[發明專利]基于RNA-m6A修飾水平的化合物篩選細胞模型及其構建與應用

有效

• 申請號: 202110353356.3
• 申請日: 2021-04-01
• 公開（公告）號: CN112899238B
• 公開（公告）日: 2023-09-26
• 發明（設計）人: 周君;劉曉敏;甘銜清;王申
• 申請（專利權）人: 中國藥科大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/85;C12N15/113;C12N15/65;C12N15/66;C12Q1/02;G01N21/64
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 競存;徐冬濤

本發明涉及一種基于Nsupgt;6/supgt;?甲基腺嘌呤(Nsupgt;6/supgt;?methyladenosin，msupgt;6/supgt;A)水平的化合物篩選細胞模型，以及該模型的構建及應用。利用RNA?msupgt;6/supgt;A甲基化修飾調控RNA穩定性的原理，首先使用基因工程技術構建攜帶msupgt;6/supgt;A修飾基序的表達載體，進一步利用該載體構建能夠反映msupgt;6/supgt;A修飾水平的細胞模型，最終通過細胞熒光強度差異計算化合物對msupgt;6/supgt;A修飾水平的影響。此細胞篩選模型相較于熒光定量PCR、蛋白免疫印跡等檢測方法，具有操作簡單、通量高、靈敏度強的優勢。

技術領域

本發明涉及一種基于N⁶-甲基腺嘌呤(N⁶-methyladenosin，m⁶A)修飾水平的化合物篩選細胞模型，以及該模型的構建及應用。

背景技術

m⁶A是RNA上含量最豐富的化學修飾，在病毒、細菌、酵母、植物和哺乳動物中普遍存在。其受甲基轉移酶、去甲基化酶及識別蛋白共同調控，主要分布在mRNA的3’非翻譯區(untanslated?region，UTR)，核心基序為RRACH(R，嘌呤；H，非鳥嘌呤堿基)。研究結果顯示，m⁶A通過調節mRNA的降解、翻譯、可變剪切以及mRNA的細胞定位等角度影響mRNA的功能與命運，在生理及病理過程中發揮了重要作用。

近年的多個研究結果顯示m⁶A修飾水平能夠調控腫瘤干細胞的自我更新以及致瘤能力；m⁶A相關蛋白的異常表達與腫瘤的發展、轉移、耐藥性、不良預后及復發顯著相關。例如，肥胖相關基因(Fat?mass?and?obesity?associated，FTO)作為m⁶A去甲基化酶，在急性髓細胞性白血病(Acute?myeloid?leukemia，AML)中起著至關重要的致癌作用。FTO通過降低mRNA轉錄物中的m⁶A水平來調節靶基因的表達，從而增強白血病致癌基因所介導的細胞轉化和白血病發生。另一方面，也有研究證明類甲基轉移酶3(Methyltransferase?like3，METTL3)及類甲基轉移酶14(Methyltransferase?like?14，METTL14)在正常骨髓生成和AML發病機制中起著關鍵作用。除此之外，有研究證明m⁶A修飾在阿爾茲海默癥、肥胖、2-型糖尿病、肝細胞癌等疾病具有重要作用。由此可見，m⁶A修飾及其調控蛋白是重要的疾病治療的新靶點，針對該修飾的藥物篩選模型的開發具有重要的實踐意義和社會價值。

目前已發現并鑒定的m⁶A抑制劑或激活劑較少，靈敏且高效的的m⁶A相關化合物篩選模型的建立將有助于化合物的開發。因此，急需開發一種基于m⁶A修飾水平的化合物篩選細胞模型。

發明內容

本發明針對該問題，利用m⁶A調控轉錄本穩定性的原理，開發了基于m⁶A修飾水平的化合物篩選細胞模型，模型示意圖如圖1所示。本發明基因工程技術構建了可表達富含m⁶A修飾轉錄本的熒光蛋白表達載體。我們首先選取轉錄本3’UTR區域富含m⁶A位點且易受YTHm⁶A結合蛋白2(YTH?N⁶-methyladenosine?RNA?binding?protein?2，YTHDF2)識別的基因序列；進一步將其構建在增強型綠色熒光蛋白基因(Enhanced?Green?Fluorescent?Protein，EGFP)的3’UTR區域；利用YTHDF2蛋白識別m⁶A修飾調控轉錄本穩定性的原理，調節EGFP表達水平，最終在細胞水平通過熒光強度的變化來反映EGFP基因的3’UTR區域上的m⁶A水平的變化。通過該模型，可以快速高效地對化合物進行篩選，獲得調控m⁶A水平的化合物。