[發(fā)明專利]一種黑曲霉葡萄糖氧化酶基因的高效表達(dá)方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110348363.4
• 申請日: 2021-03-31
• 公開（公告）號: CN114058637A
• 公開（公告）日: 2022-02-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張嬋娟;任陽奇;黨卓;閆凌鵬;麻嘯濤;胡紅偉;張軍峰;楊大謀;陳勃生;石玉佩
• 申請（專利權(quán)）人: 山西大禹生物工程股份有限公司
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N15/67;C12N15/53;C12N15/61;C12N9/04;C12R1/84
• 代理公司: 北京中企鴻陽知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11487
• 代理人: 汪斌

本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種葡萄糖氧化酶的編碼基因及其基因工程表達(dá)菌株。本發(fā)明提供了一種黑曲霉葡萄糖氧化酶基因的高效巴斯德畢赤酵母表達(dá)方法。為了提高重組酶的正確折疊，在工程菌中通過串聯(lián)載體構(gòu)建，引入了蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶pdi基因，幫助蛋白質(zhì)折疊，提高酶的表達(dá)活性。本發(fā)明還提供了一種畢赤酵母生產(chǎn)葡萄糖氧化酶的發(fā)酵培養(yǎng)基組成及工藝。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種黑曲霉葡萄糖氧化酶基因的高效表達(dá)方法。

背景技術(shù)

葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase,GOD,EC 1.1.3.4)是一種重要的工業(yè)用酶，在有氧條件下，GOD能夠?qū)Ｒ恍缘膶⑵咸烟茄趸善咸烟撬岷瓦^氧化氫。GOD在食品、傳感器、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域以及畜牧行業(yè)中均具有廣泛的應(yīng)用。在食品中，GOD作為抗氧化劑和綠色抗菌劑能夠有效抑制好氧菌生長，延長食品貨架期；在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，GOD已被廣泛用于口腔護(hù)理和美白，也被用于建立H₂O₂氧化應(yīng)激模型進(jìn)行病理研究。GOD的另外一個重要的應(yīng)用是葡萄糖的酶生物傳感器，原理是將GOD固定于電極上，用電子傳遞介質(zhì)來提高酶的氧化還原活性中心與電極表面的電子傳遞，將酶促反應(yīng)中反應(yīng)物的消耗或是產(chǎn)物的生成轉(zhuǎn)換為電信號從而記錄下來。

GOD在動物養(yǎng)殖業(yè)中也有著廣泛的應(yīng)用。研究表明，在飼料中添加GOD能夠降低消化道pH值、提高消化酶活性和營養(yǎng)物質(zhì)的消化率、改善腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)。GOD還能夠消耗氧氣創(chuàng)造利于有益厭氧菌生存的腸道環(huán)境，產(chǎn)生的H₂O₂能夠抑制大腸桿菌、沙門氏菌等腸道病原菌繁殖，維持腸道微生態(tài)系統(tǒng)平衡。GOD還能緩解氧化應(yīng)激、使畜禽保持健康、提高母畜繁殖性能，進(jìn)而提高畜禽的生產(chǎn)性能并改善畜產(chǎn)品的品質(zhì)。

多種動植物和微生物均能產(chǎn)生GOD，目前GOD主要由曲霉和青霉生產(chǎn)。目前，GOD已經(jīng)能工業(yè)化生產(chǎn)，但由于飼料工業(yè)的特殊性(如高溫制粒)，開發(fā)耐熱性好的GOD具有非常重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供一種黑曲霉葡萄糖氧化酶基因的高效表達(dá)方法，按照先后順序包括以下步驟：

(1)取黑曲霉DY-2015斜面菌種，接種滅菌的PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)，收集菌絲體，置于液氮中研磨，取細(xì)粉，加入緩沖液，溶解后，離心，取上清液，抽提，上清液加NaAc，再加無水乙醇，混勻后置于冰上，離心，沉淀用冰冷乙醇洗滌兩次，置于超凈工作臺中吹干，用20μL滅菌水溶解，用Nanodrop2000測定DNA濃度；

(2)設(shè)計(jì)引物，F(xiàn)：5’-ATGCAGACTCTCCTTGTGAG-3’；R：5’-TCACTGCATGGAAGCATAATG-3’，以步驟1提取的黑曲霉DY-2015基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

(3)根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性，優(yōu)化黑曲霉DY-2015的葡萄糖氧化酶基因dy-god，用高頻率密碼子替代低頻率密碼子，調(diào)整密碼子適應(yīng)指數(shù)指數(shù)在0.8以上，為了后續(xù)基因工程操作方便，在序列中剔除了EcoRI、BamHI、BglII、Xba I和Sac I等限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，并修改可能的提前終止序列，優(yōu)化后的基因命名為ts-god，并連接于畢赤酵母表達(dá)載體pPICzaA的多克隆位點(diǎn)EcoRI和Xba I，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌top10感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過含抗生素zeocin的LB平板篩選，獲得重組表達(dá)載體pPIC-god；

(4)從NCBI下載蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶基因pdi序列通過在線軟件優(yōu)化設(shè)計(jì)后進(jìn)行全合成，連接于pGAPzA表達(dá)載體的EcoRI和Not I酶切位點(diǎn)，構(gòu)建好的載體命名為pGAP-pdi，pGAP-pdi質(zhì)粒用BglII和BamHI雙酶切，回收大片段，與BamHI單酶切的pPIC-god載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌top10感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過抗生素zeocin篩選，獲得重組質(zhì)粒，串聯(lián)表達(dá)載體命名為pPIC-god-pdi；