[發明專利]一種黑曲霉葡萄糖氧化酶基因的高效表達方法

在審

• 申請號: 202110348363.4
• 申請日: 2021-03-31
• 公開（公告）號: CN114058637A
• 公開（公告）日: 2022-02-18
• 發明（設計）人: 張嬋娟;任陽奇;黨卓;閆凌鵬;麻嘯濤;胡紅偉;張軍峰;楊大謀;陳勃生;石玉佩
• 申請（專利權）人: 山西大禹生物工程股份有限公司
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N15/67;C12N15/53;C12N15/61;C12N9/04;C12R1/84
• 代理公司: 北京中企鴻陽知識產權代理事務所(普通合伙) 11487
• 代理人: 汪斌

1.一種黑曲霉葡萄糖氧化酶基因的高效表達方法，其特征在于，按照先后順序包括以下步驟：

(1)取黑曲霉DY-2015斜面菌種，接種滅菌的PDA培養基培養，收集菌絲體，置于液氮中研磨，取細粉，加入緩沖液，溶解后，離心，取上清液，抽提，上清液加NaAc，再加無水乙醇，混勻后置于冰上，離心，沉淀用冰冷乙醇洗滌兩次，置于超凈工作臺中吹干，用20μL滅菌水溶解，用Nanodrop2000測定DNA濃度；

(2)設計引物，F：5’-ATGCAGACTCTCCTTGTGAG-3’；R：5’-TCACTGCATGGAAGCATAATG-3’，以步驟1提取的黑曲霉DY-2015基因組DNA為模板，進行PCR擴增；

(3)根據畢赤酵母密碼子偏好性，優化黑曲霉DY-2015的葡萄糖氧化酶基因dy-god，用高頻率密碼子替代低頻率密碼子，調整密碼子適應指數指數在0.8以上，為了后續基因工程操作方便，在序列中剔除了EcoRI、BamHI、BglII、XbaI和Sac I等限制性內切酶酶切位點，并修改可能的提前終止序列，優化后的基因命名為ts-god，并連接于畢赤酵母表達載體pPICzaA的多克隆位點EcoRI和Xba I，連接產物轉化大腸桿菌top10感受態細胞，經過含抗生素zeocin的LB平板篩選，獲得重組表達載體pPIC-god；

(4)從NCBI下載蛋白質二硫鍵異構酶基因pdi序列通過在線軟件優化設計后進行全合成，連接于pGAPzA表達載體的EcoRI和NotI酶切位點，構建好的載體命名為pGAP-pdi，pGAP-pdi質粒用BglII和BamHI雙酶切，回收大片段，與BamHI單酶切的pPIC-god載體連接，轉化大腸桿菌top10感受態細胞，經過抗生素zeocin篩選，獲得重組質粒，串聯表達載體命名為pPIC-god-pdi；

(5)取重組質粒用線性化然后用PCR產物純化試劑盒純化，線性化的質粒溶于滅菌ddH₂O中電泳檢查線性化質粒純度，并用Nanodrop2000測定濃度，接種畢赤酵母x33單菌落于10mLYPD培養基中，30℃、250rpm振蕩培養12hr，轉接50mL YPD中，繼續培養至對數生長期，10,000rpm離心5min，用滅菌水和1M冰冷山梨醇洗滌，制備畢赤酵母x33感受態細胞，將線性化DNA與80μL感受態細胞混勻，置于電擊杯中，2000V、5ms電擊，電擊后，立即加入1mL冰冷的1M山梨醇，30℃恢復培養3hr，轉化后的細胞涂布于含zeocin的YPDS平板培養基，30℃培養3-4d；

(6)采用鄰-聯茴香胺分光光度法，在GOD的作用下，葡萄糖和氧反應，生成的過氧化氫和無色的還原型鄰聯茴香胺在辣根過氧化物酶的作用下，生成水和紅色的氧化型鄰聯茴香胺，通過測定反應中顏色的變化進而計算出葡萄糖氧化酶的活性；

(7)挑取單菌落，接種5mL YPD液體培養基，28℃250rpm振蕩培養24h，轉接到500mL YPD培養基，相同條件下培養12h，將種子液接種到30升發酵罐中，發酵罐中含有10L已滅菌基礎培養基，30℃400rpm培養，基礎培養基培養24h后，發酵液相對溶氧濃度上升接近100％，表明碳源耗盡，開始補料階段，補料為50％滅菌甘油，待濕菌重達到300g/L以上時，停止補料，使菌體饑餓1-2h，以耗盡碳源。然后開始甲醇誘導階段，每升培養基每min流加甲醇0.2mL，3h以后提高到每min流加甲醇0.5mL，每升甲醇中添加PTM1微量鹽4.35mL、0.35gα-酮戊二酸、10mM精氨酸。發酵過程中通過氨水調節pH值，確保pH在5.5～6.0之間。通過轉速調節，確保相對溶氧在20％以上。每12h測定濕菌重和酶活性的變化。

2.根據權利要求1所述的一種黑曲霉葡萄糖氧化酶基因的高效表達方法，其特征在于，PDA培養基：去皮馬鈴薯200g，加水800mL，煮沸30min，過濾，上清液加葡萄糖20g，定容到1L，高壓滅菌；LB培養基：2％胰蛋白胨、1％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0；低鹽LB培養基：2％胰蛋白胨、1％酵母提取物、0.5％NaCl，pH7.0；YPD培養基：1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖，固體平板另外加1.5％瓊脂。YPDS培養基：1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖、1.5％瓊脂、1M山梨醇。