[發(fā)明專利]高效合成α-酮戊二酸的基因工程菌及其在合成α-酮戊二酸中的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110347710.1
• 申請(qǐng)日: 2021-03-31
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113106046B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-11-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐恒德;劉龍;堵國(guó)成;李江華;呂雪琴;劉克;張西進(jìn);朱玉欽;李建波;劉家印
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 大自然生物集團(tuán)有限公司
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/53;C12N15/70;C12N9/06;C12P7/50;C12R1/19
• 代理公司: 濰坊博強(qiáng)專利代理有限公司 37244
• 代理人: 李偉

本發(fā)明公開(kāi)了一種高效合成α?酮戊二酸的基因工程菌及其在合成α?酮戊二酸中的應(yīng)用，通過(guò)大腸桿菌為宿主表達(dá)L?氨基酸脫氨酶Pm1的Escherichia coli BL21(DE3)，所述L?氨基酸脫氨酶Pm1通過(guò)質(zhì)粒pET20b?N2?pm1?Q100I在大腸桿菌BL21中表達(dá)；大腸桿菌宿主為表達(dá)L?氨基酸脫氨酶Pm1的Escherichia coli BL21(DE3)，所述L?氨基酸脫氨酶Pm1通過(guò)質(zhì)粒pET20b?N2?pm1?Q100I在大腸桿菌BL21中表達(dá)，提高了L?氨基酸脫氨酶Pm1的酶活和表達(dá)量的方法，通過(guò)L?氨基酸脫氨酶Pm1的基因序列的N端融合了N端編碼序列，重組質(zhì)粒構(gòu)建獲得的質(zhì)粒pET20b?N2?pm1?Q100I應(yīng)用到合成α?酮戊二酸中，合成效率高、難度小且污染低。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，尤其涉及一種高效合成α-酮戊二酸的基因工程菌，還涉及該工程菌在合成α-酮戊二酸中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

α-酮戊二酸是微生物三羧酸循環(huán)中重要的代謝中間產(chǎn)物，是連接細(xì)胞內(nèi)碳-氮代謝的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和化學(xué)合成行業(yè)。然而，化學(xué)法合成α-酮戊二酸對(duì)環(huán)境的污染較大，而微生物直接發(fā)酵法中，產(chǎn)物的成分復(fù)雜且分離難度大。生物催化法合成α-酮戊二酸可以克服上述兩種方法的缺點(diǎn)和不足，在工業(yè)應(yīng)用中具有廣闊前景。

L-氨基酸脫氨酶(EC 1.4.3.2)廣泛存在于自然界各種生物中。不同來(lái)源的L-氨基酸脫氨酶具有高度保守性，其主要區(qū)別為每類L-氨基酸脫氨酶均對(duì)特定的一種或幾種氨基酸或其氨基酸衍生物表現(xiàn)出較高的底物親和性，而對(duì)其他氨基酸的親和性較差。有研究表明，Proteus mirabilis來(lái)源的L-氨基酸脫氨酶Pm1，能催化L-谷氨酸生成α-酮戊二酸。

大腸桿菌(Escherichia coli)BL21(DE3)是一種可用于高效表達(dá)含T7啟動(dòng)子的表達(dá)載體的菌株，其遺傳背景清晰，分子操作工具成熟且多樣，是一種被廣泛用作表達(dá)重組蛋白的生產(chǎn)宿主。

半理性設(shè)計(jì)策略是酶工程改造的一種重要策略，分子對(duì)接是常用的半理性設(shè)計(jì)手段。分子對(duì)接是利用計(jì)算機(jī)模擬并分析分子間(如配體和受體)相互作用，并預(yù)測(cè)其結(jié)合模式和親合力的一種理論模擬方法，可預(yù)測(cè)出蛋白待突變的位點(diǎn)，進(jìn)而通過(guò)定點(diǎn)飽和突變篩選出酶活提高的突變體。

近年來(lái)，N端編碼序列被證實(shí)對(duì)蛋白的表達(dá)有調(diào)控作用。因此，可以通過(guò)在基因N端添加對(duì)蛋白表達(dá)促進(jìn)作用較強(qiáng)的編碼序列，以篩選得到蛋白表達(dá)水平提高的菌株。

但如何利用大腸桿菌，通過(guò)全細(xì)胞催化法高效合成α-酮戊二酸，仍是本領(lǐng)域亟待解決的問(wèn)題之一。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種能夠大幅提高酶活和表達(dá)量，且α-酮戊二酸合成率高的高效合成α-酮戊二酸的基因工程菌。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的技術(shù)方案是：高效合成α-酮戊二酸的基因工程菌，大腸桿菌宿主為表達(dá)L-氨基酸脫氨酶Pm1的Escherichia coli BL21(DE3)，所述L-氨基酸脫氨酶Pm1通過(guò)質(zhì)粒pET20b-N2-pm1-Q100I在大腸桿菌BL21中表達(dá)。

作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述L-氨基酸脫氨酶Pm1的基因序列的N端融合了N端編碼序列，且第100位的谷氨酰胺突變?yōu)楫惲涟彼幔纬伤鲑|(zhì)粒pET20b-N2-pm1-Q100I，所述質(zhì)粒pET20b-N2-pm1-Q100I的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述質(zhì)粒pET20b-N2-pm1-Q100I的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

(1)分子對(duì)接與飽和突變位點(diǎn)的選擇

在SWISS MODEL數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索所述L-氨基酸脫氨酶Pm1的同源酶晶體模型，選擇的所述同源酶晶體模型的同源性至少為90％；