[發明專利]高效合成α-酮戊二酸的基因工程菌及其在合成α-酮戊二酸中的應用

有效

• 申請號: 202110347710.1
• 申請日: 2021-03-31
• 公開（公告）號: CN113106046B
• 公開（公告）日: 2022-11-25
• 發明（設計）人: 徐恒德;劉龍;堵國成;李江華;呂雪琴;劉克;張西進;朱玉欽;李建波;劉家印
• 申請（專利權）人: 大自然生物集團有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/53;C12N15/70;C12N9/06;C12P7/50;C12R1/19
• 代理公司: 濰坊博強專利代理有限公司 37244
• 代理人: 李偉

1.高效合成α-酮戊二酸的基因工程菌，其特征在于：大腸桿菌宿主為表達L-氨基酸脫氨酶Pm1的Escherichia coli BL21（DE3），所述L-氨基酸脫氨酶Pm1通過質粒pET20b-N2-pm1-Q100I在大腸桿菌BL21中表達；

所述L-氨基酸脫氨酶Pm1的基因序列的N端融合了N端編碼序列，且第100位的谷氨酰胺突變為異亮氨酸，形成所述質粒pET20b-N2-pm1-Q100I，所述質粒pET20b-N2-pm1-Q100I的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一種權利要求1所述的高效合成α-酮戊二酸的基因工程菌，所述質粒pET20b-N2-pm1-Q100I的構建方法，包括如下步驟：

（1）分子對接與飽和突變位點的選擇

在 SWISS MODEL 數據庫中搜索所述L-氨基酸脫氨酶Pm1的同源酶晶體模型，選擇的所述同源酶晶體模型的同源性至少為90%；

利用Discovery Studio軟件，將所述同源酶晶體模型的三維蛋白結構文件和底物L-谷氨酸的三維結構文件，進行分子對接；

選擇關鍵位點進行定點飽和突變，設計引物，以質粒pET20b-pm1為模板，全質粒PCR擴增，將PCR產物分別轉入大腸桿菌BL21中表達，進行催化驗證，經篩選獲得Q100I的正向突變菌株；

（2）融合N端編碼序列的重組質粒構建

根據N端編碼序列和pm1的基因序列，設計引物，以質粒pET20b-pm1-Q100I為模板，全質粒PCR擴增，將PCR產物分別轉入大腸桿菌JM109中，測序驗證，將構建成功的N端融合重組質粒分別轉化入大腸桿菌BL21中，進行全細胞催化驗證，獲得正向突變的N2菌株。

3.如權利要求2所述的高效合成α-酮戊二酸的基因工程菌，其特征在于：

選中的所述同源酶晶體模型為模型5fjm.1A，所述模型5fjm.1A與L-氨基酸脫氨酶Pm1的同源性高達93.51%；

所述同源酶晶體模型的三維蛋白結構文件包括輔酶FAD的結構；

進行定點飽和突變選擇的關鍵位點為Gln281、Phe318，分別對應L-氨基酸脫氨酶Pm1的Q100、W439、R316和Y98。

4.如權利要求1至3任一權利要求所述的基因工程菌在合成α-酮戊二酸中的應用，利用所述基因工程菌全細胞催化L-谷氨酸生成α-酮戊二酸。

5.如權利要求4所述的基因工程菌在合成α-酮戊二酸中的應用，其特征在于：所述基因工程菌全細胞的獲得方法為，

將所述基因工程菌接種至發酵培養基中，在25～37℃的溫度環境中培養，以0.005～0.02 mM的IPTG進行誘導10～15h，離心收集獲得基因工程菌全細胞。

6.如權利要求5所述的基因工程菌在合成α-酮戊二酸中的應用，其特征在于：將所述基因工程菌接種至發酵培養基時，種子液以OD值0.1～0.2的接種量接入發酵培養基中，當OD值達到2時，在25～30℃溫度環境中，以0.01mM的IPTG進行誘導12h，離心收集全細胞。

7.如權利要求6所述的基因工程菌在合成α-酮戊二酸中的應用，其特征在于：所述發酵培養基的配方為：蛋白胨12g/L、酵母提取物24 g/L、甘油4 g/L、磷酸氫二鉀2.31 g/L、三水磷酸氫二鉀16.42g/L。

8.如權利要求6所述的基因工程菌在合成α-酮戊二酸中的應用，其特征在于：所述基因工程菌全細胞的催化方法為，

將離心收集的全細胞用緩沖液懸浮后，加入底物L-谷氨酸，在30℃溫度環境中、220rpm的IPTG催化條件下催化反應24h。

9.如權利要求8所述的基因工程菌在合成α-酮戊二酸中的應用，其特征在于：催化反應在250mL的三角瓶中進行，催化體系總體積為25mL，細胞8g/L ，L-谷氨酸105g/L，緩沖液為pH為7.0的0.1M的磷酸鈉緩沖液。