[發明專利]一種能產生抗卡痛單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 202110345124.3
• 申請日: 2021-03-30
• 公開（公告）號: CN113122506B
• 公開（公告）日: 2023-07-25
• 發明（設計）人: 鄭智彪;鄭曙劍
• 申請（專利權）人: 杭州隆基生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/16;C07K14/765;C07K1/107;G01N33/577;G01N33/58;G01N33/532;G01N33/558;C07D471/14
• 代理公司: 杭州杭誠專利事務所有限公司 33109
• 代理人: 尉偉敏;何俊

1.一種能產生抗卡痛單克隆抗體的雜交瘤細胞株，其特征在于：其命名為雜交瘤細胞株Kratom?11B7，已于2021年1月31日保藏于中國典型培養物保藏中心；保藏號為CCTCCNO：C202146。

2.一種如權利要求1所述雜交瘤細胞株的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

步驟1：帽柱木堿完全抗原的制備：以帽柱木堿為原料，先用三氟乙酸酐保護仲胺基，再用氫氧化鋰水解甲酯得到羧基，在羧基位點引入5-氨基戊酸增加臂長，得到帽柱木堿半抗原，通過碳二亞胺法使帽柱木堿半抗原偶聯載體蛋白后，脫去保護基，得到帽柱木堿完全抗原；

步驟2：7羥基帽柱木堿完全抗原的制備：以7羥基帽柱木堿為原料，用氫氧化鋰水解甲酯得到羧基，在羧基位點引入5-氨基戊酸增加臂長，得到7羥基帽柱木堿半抗原，通過碳二亞胺法使7羥基帽柱木堿半抗原偶聯載體蛋白后，得到7羥基帽柱木堿完全抗原；

步驟3：雜交瘤細胞株的制備：用帽柱木堿完全抗原和7羥基帽柱木堿完全抗原共同免疫小鼠，得到雜交瘤細胞株Kratom11B7。

3.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于：步驟3中，所述雜交瘤細胞株通過皮下免疫、靜脈免疫結合的連續增強刺激免疫方法獲得。

4.如權利要求3所述的制備方法，其特征在于：步驟3包括：

步驟3.1：免疫；

步驟3.2：脾細胞與骨髓瘤細胞的融合；

步驟3.3：雜交瘤細胞的篩選。

5.如權利要求4所述的制備方法，其特征在于：步驟3.1具體為：

將帽柱木堿完全抗原和7羥基帽柱木堿完全抗原按質量比（0.8-1.2）:1混合，然后用PBS緩沖液稀釋濃度為0.8-1.2mg/ml；第1天免疫再將稀釋后的抗原和完全佐劑按質量比（0.8-1.2）:1混合，在小鼠皮下注射3-7ug/只，第6天用不完全佐劑混合抗原，在小鼠淋巴結附近注射8-12ug/只，第11天在小鼠淋巴結附近注射13-17ug/只，第16天在小鼠淋巴結附近注射18-22ug/只，第21天在小鼠淋巴結附近注射23-27ug/只，第24天在小鼠靜脈直接注射3-7ug/只。

6.如權利要求5所述的制備方法，其特征在于：步驟3.2具體為：

步驟3.2.1：飼養細胞懸液制備：小鼠摘眼球放血處死，浸泡于酒精中消毒，撕開小鼠腹外皮膚，暴露其腹膜，注入35-40℃預熱的DMEM無血清培養基，輕揉小鼠腹腔1-2分鐘，懸浮腹腔細胞，吸出腹腔液；剪開小鼠胸腔取胸腺研磨后收集懸液，與腹腔液合并離心，沉淀物用HAT完全培養液重懸，得到飼養細胞懸液；

步驟3.2.2：小鼠骨髓瘤細胞SP2/0的培養：把小鼠骨髓瘤細胞SP2/0用含體積分數為8-12﹪FBS的DMEM培養基進行傳代培養，細胞融合前一天進行傳代以保證小鼠骨髓瘤細胞SP2/0適合生長對數期，生長狀態良好用于細胞融合；

步驟3.2.3：脾細胞制備：將上述免疫的小鼠處死，泡酒精中消毒后剖腹，無菌取出脾臟，將脾臟放在連接著離心管的濾網上，立即加入無血清的DMEM培養液，用眼科剪剪碎脾臟，然后用無菌注射器柄輕磨脾臟，使脾臟細胞經過網孔濾入離心管內，加無血清培養液，離心；棄上清用無血清培養液重復離心，待用；

步驟3.2.4：脾細胞與骨髓瘤細胞融合：將脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0混合均勻，離心洗滌細胞，去除上清液，置于35-40℃水浴，加入0.5-1.0ml35-40℃預溫的PEG4000，一分鐘內加完，然后靜止80-100秒；再加入20-30ml35-40℃預溫的DMEM無血清培養液終止PEG作用；離心，取沉淀；然后在沉淀中加入飼養細胞懸液，接種到96孔細胞培養板中，置于35-40℃，3-7﹪CO₂培養箱中培養；20-30小時后，采用HAT培養基，HAT選擇培養液維持培養兩周后，改用HT培養液，再維持培養兩周，改用一般培養液，獲得融合細胞。