[發明專利]一種從甕棺土樣中提取羊毛角蛋白進行蛋白質組學檢測的方法在審
| 申請號： | 202110345115.4 | 申請日： | 2021-03-31 |
| 公開（公告）號： | CN112986582A | 公開（公告）日： | 2021-06-18 |
| 發明（設計）人： | 王秉;周杰;鄭海玲;彭志勤;萬軍民 | 申請（專利權）人： | 浙江理工大學 |
| 主分類號： | G01N33/68 | 分類號： | G01N33/68;G01N33/543 |
| 代理公司： | 浙江永航聯科專利代理有限公司 33304 | 代理人： | 蔡鼎 |
| 地址： | 310018 浙江省杭州市錢塘*** | 國省代碼： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 甕棺土樣中 提取 羊毛 角蛋白 進行 蛋白質 檢測 方法 | ||
1.一種從甕棺土樣中提取羊毛角蛋白進行蛋白質組學檢測的方法，其特征在于包括以下步驟：
1）取500mg氨基化的磁性納米顆粒，加入到40-60mL PBS緩沖液中，超聲分散；加入150-250mL、20-30wt%戊二醛溶液，在30-40℃的振蕩水浴鍋中振蕩反應2-3小時；
2）磁性分離固液相，用PBS緩沖液清洗3-5遍，之后將活化后的磁性納米顆粒分散在40-60mL PBS緩沖液中，得到5-15mg/mL的磁性納米粒子溶液；
3）取30mL上述磁性納米粒子溶液，向其中加入含有20-55mg兔抗角蛋白單克隆抗體的BSA溶液，在30-40℃下振蕩反應1-3h；
4）取100mg混有羊毛角蛋白的甕棺土樣溶解在碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液中，在50-80℃的震蕩水浴鍋中溶解2-3h后冷卻；
5）用PBS緩沖液洗滌步驟3）中所得的免疫磁珠，加入步驟4）中所得的甕棺土樣提取液，在30-40℃條件下震蕩孵育1-3h；
6）磁性分離，PBS緩沖液洗滌，除去雜質和上清液，得到羊毛角蛋白結合的免疫磁珠；
7）對羊毛角蛋白結合的免疫磁珠進行蛋白質組學分析，得到蛋白序列數據。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟1）、2）、5）、6）中PBS緩沖液的pH=7.4。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟1）中，所述戊二醛溶液的溶劑為pH=7.4的PBS。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟3）中，兔抗羊毛角蛋白抗體為全序列抗體，BSA溶液中BSA的濃度為8-12mg/mL；抗體稀釋倍數為1:1000-1500。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟4）中，碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液的pH=9.6。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟5）中，震蕩過程中定時進行上下顛倒，使甕棺土樣提取液成均勻懸濁液。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟6）中，磁性分離時外部磁性物體置于底部，上下顛倒，多次重復，最終磁體在上，甕棺土樣在下，直接從下口除去土樣和多余液體。
8.如權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟7）中，若檢測結果含有抗體，需在結果中排除。
9.如權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟1）中，所述氨基化的磁性納米顆粒的合成步驟為：
a. 稱取4.78g FeCl3·6H2O和2.78g FeSO4·7H2O溶解在蒸餾水中，將溶液倒入容器中，在充氮氣的條件下攪拌至溶解；加入3.2g NaOH，80-90℃水浴持續攪拌0.5-1.5h制得Fe3O4磁性納米顆粒，磁性分離，倒掉上清液，用乙醇和蒸餾水多次洗滌保存在去離子水中；
b. 移取500mg含有納米磁珠的磁性液體，溶解在250-350mL無水乙醇中，超聲至完全分散，加入25-35mL APTES，用氨水調節pH至10.5-11.5，然后在55-65℃水浴中攪拌反應4-6h；結束后，用無水乙醇洗滌。
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