[發(fā)明專利]一種高靈敏SARS-CoV-2中和抗體的檢測方法、檢測試劑盒

有效

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• 申請日: 2021-03-31
• 公開（公告）號: CN112730851B
• 公開（公告）日: 2021-06-22
• 發(fā)明（設計）人: 張玉基
• 申請（專利權）人: 南京立頂醫(yī)療科技有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/569;G01N33/558;G01N33/543
• 代理公司: 南京佰騰智信知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 32509
• 代理人: 胡麗華

本發(fā)明公開了一種高靈敏SARS?CoV?2中和抗體的檢測方法、檢測試劑盒，屬于生物醫(yī)學檢測技術領域，本發(fā)明試劑盒包括層析試紙、卡殼和樣本稀釋液，所述層析試紙包括底板、樣品墊、結合墊、NC膜和吸水墊，所述NC膜上依次設置有捕獲線、檢測線和質控線，所述捕獲線包被有ACE2蛋白，所述檢測線包被有RBD蛋白，所述結合墊設置有RBD蛋白標記物；本發(fā)明采用阻斷法加夾心法原理提高檢測中和抗體的靈敏度，通過添加捕獲線的方式，將靶向RBD的非中和抗體提前捕獲，保證后續(xù)通過夾心法檢測中和抗體的特異性。

技術領域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)學檢測技術領域，尤其涉及一種高靈敏SARS-CoV-2中和抗體的檢測方法、檢測試劑盒。

背景技術

新型冠狀病毒肺炎（新冠肺炎，COVID-19）的病原為新型冠狀病毒，屬于β屬的冠狀病毒，有包膜，顆粒呈圓形或橢圓形，直徑60～140nm。具有5個必需基因，分別針對核蛋白（N）、病毒包膜（E）、基質蛋白（M）和刺突蛋白（S）4種結構蛋白及RNA依賴性的RNA聚合酶（RdRp）。核蛋白（N）包裹RNA基因組構成核衣殼，外面圍繞著病毒包膜（E），病毒包膜包埋有基質蛋白（M）和刺突蛋白（S）等蛋白。刺突蛋白（S）通過受體結合位點（RBD）結合宿主的血管緊張素轉化酶2（ACE-2）進入細胞。S蛋白是病毒進入人體的關鍵，是疫苗和治療性中和抗體的主要靶點。S蛋白的受體結合（RBD）結構域可與宿主ACE2受體結合，介導病毒入侵宿主細胞，也是大多數(shù)有效的中和抗體的結合部位。

中和抗體與RBD結構域結合后，可使病毒失去吸附、入侵宿主細胞能力，從而抑制病毒在宿主體內(nèi)復制傳播的抗體，病毒中和抗體在清除宿主體內(nèi)的病毒中起著重要作用。

傳統(tǒng)中和抗體檢測的“金標準”是感染抑制試驗，主要是先將病毒與待檢測抗體進行混合，再將混合物接種到敏感動物、胚胎或細胞，通過敏感動物、胚胎或細胞的病變情況來測定殘存的病毒感染力，從而間接確定待檢測抗體對病毒的中和效果。其中在體外進行利用活病毒進行蝕斑減少中和試驗（plaque reduction neutralizationtest，PRNT）和通過檢測細胞病變（cytopathic effct，CPE）量來進行分析的微量細胞中和試驗是常用方法。

對于新型冠狀病毒烈性病毒性傳染病來講，即使是體外實驗也面臨活病毒株來源和需要在高等級生物安全實驗室操作的限制，杜克-新加坡國立大學醫(yī)學院新發(fā)傳染病重點研究項目主任王林發(fā)教授帶領的研究團隊，基于中和抗體可阻斷RBD和ACE2結合的原理開發(fā)了阻斷ELISA的cPass血清檢測盒，由金斯瑞生物進行商業(yè)化推廣，并獲FDA授權用于恢復期血漿篩查。但仍存在檢測操作繁瑣、耗時長的缺點。之后，多家公司基于此原理開發(fā)了側向層析試紙條，主要方法是將ACE2劃到膜上，并用膠體金標記RBD蛋白。當樣本中無中和抗體時候，膠體金標記的RBD和ACE2結合形成檢測線。樣本中有中和抗體時，中和抗體阻斷RBD和ACE2的結合，從而降低檢測線的顯色強度。通過機器判讀，或者檢測線顯色強度的深淺變化來判斷中和抗體存在情況。肉眼判讀時候需要檢測線深淺有較大變化才能做判定，此形式檢測卡的靈敏度有待提高。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術中SARS-CoV-2中和抗體檢測操作繁瑣、耗時長，靈敏度低的技術問題，提供一種簡便、快速、靈敏度高的SARS-CoV-2中和抗體的檢測方法、檢測試劑盒。本發(fā)明的技術方案如下：

一種高靈敏SARS-CoV-2中和抗體的檢測方法，其特征在于，基于夾心法結合阻斷法實現(xiàn)SARS-CoV-2中和抗體的檢測。

優(yōu)選的，高靈敏SARS-CoV-2中和抗體的檢測方法通過提前捕獲非中和抗體，增強后續(xù)通過夾心法檢測中和抗體的特異性。

優(yōu)選的，高靈敏SARS-CoV-2中和抗體的檢測方法以ACE2蛋白為捕獲物，阻斷非中和抗體，通過形成包被RBD蛋白-中和抗體-RBD蛋白-標記載體復合物，實現(xiàn)SARS-CoV-2中和抗體的檢測。