[發明專利]一種卡痛抗原及其制備方法、應用

在審

• 申請號: 202110344150.4
• 申請日: 2021-03-30
• 公開（公告）號: CN113354725A
• 公開（公告）日: 2021-09-07
• 發明（設計）人: 鄭智彪;鄭曙劍
• 申請（專利權）人: 杭州隆基生物技術有限公司
• 主分類號: C07K14/765
• 分類號: C07K14/765;C07K1/107;C12N5/20;C07K16/16;C07D471/14
• 代理公司: 杭州杭誠專利事務所有限公司 33109
• 代理人: 尉偉敏;何俊

1.一種卡痛抗原，其特征在于：包括帽柱木堿完全抗原和7羥基帽柱木堿完全抗原；

所述帽柱木堿完全抗原的分子結構式如下所示：

7羥基帽柱木堿完全抗原的分子結構式如下所示：

其中，R表示載體蛋白。

2.如權利要求1所述的卡痛抗原，其特征在于：所述載體蛋白選自牛血清白蛋白、卵清蛋白、牛γ球蛋白或血藍蛋白。

3.一種卡痛抗原的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

帽柱木堿完全抗原的制備：以帽柱木堿為原料，先用三氟乙酸酐保護仲胺基，再用氫氧化鋰水解甲酯得到羧基，在羧基位點引入5-氨基戊酸增加臂長，得到帽柱木堿半抗原，通過碳二亞胺法使帽柱木堿半抗原偶聯載體蛋白后，脫去保護基，得到帽柱木堿完全抗原；

7羥基帽柱木堿完全抗原的制備：以7羥基帽柱木堿為原料，用氫氧化鋰水解甲酯得到羧基，在羧基位點引入5-氨基戊酸增加臂長，得到7羥基帽柱木堿半抗原，通過碳二亞胺法使7羥基帽柱木堿半抗原偶聯載體蛋白后，得到7羥基帽柱木堿完全抗原。

4.如權利要求3所述的制備方法，其特征在于：所述帽柱木堿完全抗原的制備包括：

a)保護氨基：將帽柱木堿溶于有機溶劑中，室溫攪拌溶解，在冰水浴、惰性氣體保護下，緩慢滴加帽柱木堿摩爾量1-3倍的三氟乙酸酐，撤去冰水浴，室溫攪拌反應；反應結束后，在水浴下減壓蒸干溶劑，得淡黃色油液體，加入正己烷溶解，在冰水浴中結晶成白色固體，用正己烷洗滌白色固體；

b)水解酯基：向所得白色固體中加入甲醇和水，再加入其5-10倍摩爾量的氫氧化鋰，攪拌溶解后繼續反應；反應結束，用薄板層析分析，原料Rf＝0.6-0.8，產物Rf＝0.2-0.4，用稀鹽酸調pH＝4.5-5.5，在水浴下減壓蒸干溶劑；加入無水乙醇溶解，過濾，將溶劑減壓蒸干；用薄板層析法分離，以石油醚/甲醇混合溶液作為展開劑，紫外下收集Rf＝0.2-0.4的產物點，收集所得硅膠用無水乙醇反復提取，混合后，減壓蒸去無水乙醇，得到淡黃色油狀物帽柱木堿酸；

c)增加臂長引入羧基：將所得帽柱木堿酸溶于吡啶，加入其1-3倍摩爾量的5-氨基戊酸，再加入與5-氨基戊酸等摩爾量的EDC室溫攪拌；反應結束后，減壓蒸去溶劑，加二氯甲烷溶解，萃取多次，取下層有機相，有機相干燥，過濾，減壓蒸去溶劑；用薄板層析法分離，以95wt％乙醇/氨水/二氯甲烷/1，4-二氧六環混合溶液作為展開劑，紫外下收集Rf＝0.4-0.5的產物點，收集所得硅膠用無水乙醇反復提取，混合后，減壓蒸去無水乙醇，得到油狀物，即帽柱木堿半抗原；

d)活化偶聯載體蛋白：將所得帽柱木堿半抗原溶于二甲基甲酰胺中，加入帽柱木堿半抗原0.4-0.5倍質量的N-羥基琥珀酰亞胺和帽柱木堿半抗原0.7-0.8倍質量的二環己基碳二亞胺，室溫下攪拌過夜，離心，取上清；以1∶3-5的體積比將上清加入至8-12mg/ml的載體蛋白/PBS溶液中，混合均勻，室溫攪拌反應后，靜置過夜；將反應液置入pH為11-13的碳酸鈉溶液中進行透析，再用PBS緩沖液中進行透析，期間每天換緩沖液；透析結束后，將反應液離心，取上層清液即為帽柱木堿完全抗原。