[發明專利]一種酸性蛋白酶突變體及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 202110342505.6
• 申請日: 2021-03-30
• 公開（公告）號: CN113151330B
• 公開（公告）日: 2023-09-08
• 發明（設計）人: 黃遵錫;楊正鳳;韓楠玉;胡懋;魏婷柳
• 申請（專利權）人: 云南師范大學
• 主分類號: C12N15/57
• 分類號: C12N15/57;C12N9/62;C12N15/81;C12N15/10;C12R1/84
• 代理公司: 北京中仟知識產權代理事務所(普通合伙) 11825
• 代理人: 田江飛

一種酸性蛋白酶突變體及其制備方法和應用，所述酸性蛋白酶突變體為酸性蛋白酶PepA的雙位點突變體PepA?N11R/N12S，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。所述酸性蛋白酶突變體為酸性蛋白酶PepA的復合位點突變體PepA?N11R/N12S?E110R，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。

技術領域

本發明涉及基因工程、酶工程的蛋白分子改造領域，特別涉及一種經定點突變改造熱穩定性提高的酸性蛋白酶突變體。

背景技術

酸性蛋白酶又稱天冬氨酸蛋白酶，主要來源于曲霉、木霉等絲狀真菌，是一種在酸性條件下對蛋白質具有較好水解效果的蛋白酶，其在皮革加工、食品、飼料、醫學以及水產品加工等方面都具有廣泛應用。

目前酸性蛋白酶的研究主要集中于黑曲霉的表達和固態發酵，這使得酸性蛋白酶的生產存在發酵周期長、質量不穩、純化困難、勞動強度大等問題，而在其他工業真菌表達系統中的異源表達研究又相對較少。畢赤酵具有發酵成本低廉、生產雜蛋白較少等優點，是工業生產酶制劑優秀的表達系統。溫度對酶促反應的作用效率具有關鍵作用，熱穩定性的優良決定了酶對底物的催化效果的可持續性，但PepA的耐熱性較差，45℃的半衰期不到30min,60℃條件下即快速失去酶活，這極大的限制了其的工業化應用，所以通過一定的手段策略提高PepA的熱穩定性，是目前酸性蛋白酶產業化應用亟待解決的問題。定點突變是一種有效的蛋白分子改造，被廣泛應用于酶性質的改良和酶活性的提高等方面。

發明內容

為解決上述現有技術存在的問題，本發明的目的在于提供一種酸性蛋白酶突變體及其制備方法和應用。

為達到上述目的，本發明的技術方案為：

一種經定點突變改造熱穩定性提高的酸性蛋白酶突變體，所述酸性蛋白酶突變體為酸性蛋白酶PepA的雙位點突變體PepA-N11R/N12S，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

進一步的，所述酸性蛋白酶突變體為酸性蛋白酶PepA的復合位點突變體PepA-N11R/N12S-E110R，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示。

進一步的，所述酸性蛋白酶突變體為酸性蛋白酶PepA的雙位點突變體PepA-N11R/N12S的突變引物為：

PepA-N11R/N12S-F

5'-GTTACTACTCCTCAAAGATCTGACGAAGAGTACC-3'

PepA-N11R/N12S-R

5'-AGATCTTTGAGGAGTAGTAACAGCAGAACCTTTAGAAGCTGCC-3'。

進一步的，所述酸性蛋白酶突變體為酸性蛋白酶PepA的復合位點突變體PepA-N11R/N12S-E110R的突變引物為：PepA-N11R/N12S-E110R-F

5'-GTAAGATTTCAAGTAGATTTGTCCAAAACAC-3'

PepA-N11R/N12S-E110R-R

5'-TCTACTTGAAATCTTACTTGCTGCTTCAAC-3'。

進一步的，所述酸性蛋白酶突變體的最適pH為2.5，最適溫度為55℃。

進一步的，所述的經定點突變改造熱穩定性提高的酸性蛋白酶突變體的構造方法包括如下步驟：

(1)酸性蛋白酶基因PepA的序列優化及克隆：利用DNAwork對PepA進行畢赤酵母表達的序列優化后直接合成目的序列，以此序列為模板進行PCR擴增，將產物連接到pPIC9K載體上，得到重組載體pPIC9K-PepA；