[發明專利]干細胞分化誘導為肝細胞的方法

有效

• 申請號: 202110339043.2
• 申請日: 2021-03-30
• 公開（公告）號: CN113201480B
• 公開（公告）日: 2023-03-24
• 發明（設計）人: 董永聘;陳勇;馮榮;桑偉建
• 申請（專利權）人: 弗元（上海）生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 上海上谷知識產權代理有限公司 31342
• 代理人: 蔡繼清

本申請公開了一種干細胞分化誘導為肝細胞的方法。本申請中，方法包括步驟：步驟(1)，在添加有Activin A和Wnt信號通路激動劑的第一培養基中培養干細胞，收集細胞；和步驟(2)，在添加有BMP2和FGF4的第二培養基中培養步驟(1)所得的細胞，收集細胞；和步驟(3)，在添加有HGF和KGF的第三培養基中培養步驟(2)所得的細胞，收集細胞；和步驟(4)，在添加有Vc、EGF和胰島素的第四培養基中培養步驟(3)所得的細胞，收集細胞，獲得所述肝細胞，本發明提供的干細胞分化誘導為肝細胞的方法，通過加入特定的細胞因子和小分子化合物的組合可成功實現誘導干細胞分化為肝細胞。

技術領域

本發明實施例涉及生物醫藥領域，特別涉及干細胞分化誘導為肝細胞的方法。

背景技術

獲得肝細胞是構建人工肝、臨床前藥物代謝與肝毒性評估、肝再生醫學種子細胞規模生產的技術的關鍵，然而人體來源的肝細胞受限于供體數量有限、體外擴增能力弱以及容易去分化丟失功能等缺陷難以滿足對肝細胞日益擴大需求。

多能干細胞具備體外無限增殖及分化為人肝細胞的能力，現有技術中，多能干細胞分化誘導肝細胞的方法主要為單層貼璧生長法。然而單層貼壁狀態下的干細胞缺乏細胞間立體廣泛的聯系，分化獲得的肝細胞功能較弱，且分化限制于培養板面積難以收獲大量細胞，不適于肝細胞的規模制備。因此，尋找一種可規模化的、穩定的、簡便且低成本的干細胞分化誘導為肝細胞的方法成為解決人體來源肝細胞供應不足問題的關鍵。

發明內容

如本發明所用，術語“誘導性多能干細胞”指的是獲得分化多能性的細胞，即通過對體細胞轉入賦予分化多能性的幾種轉錄因子基因而獲得與胚胎干細胞同等分化多能性的細胞。

本發明實施方式的目的在于提供一種可規模化的、穩定的、簡便且低成本的干細胞分化誘導為肝細胞的方法。

為解決上述技術問題，本發明的實施方式提供了一種干細胞分化誘導為肝細胞的方法，所述方法包括步驟：

步驟(1)，在添加有Activin A和Wnt信號通路激動劑的第一培養基中培養干細胞，收集細胞；和

步驟(2)，在添加有BMP2和FGF4的第二培養基中培養步驟(1)所得的細胞，收集細胞；和

步驟(3)，在添加有HGF和KGF的第三培養基中培養步驟(2)所得的細胞，收集細胞；和

步驟(4)，在添加有Vc、EGF和胰島素的第四培養基中培養步驟(3)所得的細胞，收集細胞，獲得所述肝細胞。

在一些優選的方案中，在所述第一培養基中，所述Activin A的含量不小于10ng/mL，更優選為不小于30ng/mL，進一步優選為80～120ng/mL，最優選為90～110ng/mL，例如100ng/mL；

在所述第一培養基中，所述Wnt信號通路激動劑的含量不小于0.1μM，更優選為不小于1μM，進一步優選為1～4μM，例如2μM；

在所述第二培養基中，所述BMP2的含量不小于1ng/mL，更優選為不小于5ng/mL，進一步優選為5～30ng/mL，最優選為10～20ng/mL，例如20ng/mL；

在所述第二培養基中，所述FGF4的含量不小于1ng/mL，更優選為不小于10ng/mL，進一步優選為10～40ng/mL，最優選為20～35ng/mL，例如30ng/mL；

在所述第三培養基中，所述HGF的含量不小于1ng/mL，更優選為不小于5ng/mL，進一步優選為5～30ng/mL，最優選為10～20ng/mL，例如20ng/mL；

在所述第三培養基中，所述KGF的含量不小于1ng/mL，更優選為不小于5ng/mL，進一步優選為5～30ng/mL，最優選為10～20ng/mL，例如20ng/mL；