[發(fā)明專利]干細(xì)胞分化誘導(dǎo)為肝細(xì)胞的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110339043.2
• 申請(qǐng)日: 2021-03-30
• 公開（公告）號(hào): CN113201480B
• 公開（公告）日: 2023-03-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 董永聘;陳勇;馮榮;桑偉建
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 弗元（上海）生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/071
• 分類號(hào): C12N5/071
• 代理公司: 上海上谷知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31342
• 代理人: 蔡繼清

1.一種干細(xì)胞分化誘導(dǎo)為肝細(xì)胞的方法，其特征在于，所述方法包括步驟：

步驟（1），在添加有Activin A和Wnt信號(hào)通路激動(dòng)劑的第一培養(yǎng)基中培養(yǎng)干細(xì)胞，收集細(xì)胞，所述Wnt信號(hào)通路激動(dòng)劑為CHIR；和

步驟（2），在添加有BMP2和FGF4的第二培養(yǎng)基中培養(yǎng)步驟（1）所得的細(xì)胞，收集細(xì)胞；和

步驟（3），在添加有HGF和KGF的第三培養(yǎng)基中培養(yǎng)步驟（2）所得的細(xì)胞，收集細(xì)胞；和

步驟（4），在添加有Vc、EGF和胰島素的第四培養(yǎng)基中培養(yǎng)步驟（3）所得的細(xì)胞，收集細(xì)胞，獲得所述肝細(xì)胞；

所述干細(xì)胞為胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞；

其中，步驟（2）、步驟（3）以及步驟（4）中，所述的培養(yǎng)為懸浮培養(yǎng)；

在所述第一培養(yǎng)基中，所述Activin A的含量為10~120 ng/mL；

所述Wnt信號(hào)通路激動(dòng)劑的含量0.1-4 μM；

在所述第二培養(yǎng)基中，所述BMP2的含量1-30 ng/mL；

所述FGF4的含量1-40 ng/mL；

在所述第三培養(yǎng)基中，所述HGF的含量1-30 ng/mL；

所述KGF的含量1~30 ng/mL；

在所述第四培養(yǎng)基中，所述Vc的含量1~80μg/mL；

所述EGF的含量1-30 ng/mL；

所述胰島素的含量0.1-3 μg/mL。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述懸浮培養(yǎng)在細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器中進(jìn)行，所述細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器包括容器本體和控制裝置，進(jìn)行懸浮培養(yǎng)時(shí)，將待培養(yǎng)的細(xì)胞置于容器本體中，通過所述控制裝置控制所述容器本體通過預(yù)設(shè)的方式運(yùn)動(dòng)。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述預(yù)設(shè)的方式為旋轉(zhuǎn)、回旋、搖擺、振蕩或其組合；

其中，所述旋轉(zhuǎn)為繞所述細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器的中心軸線進(jìn)行圓周運(yùn)動(dòng)；

所述回旋為繞偏離所述細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器中心的軸線進(jìn)行偏心回轉(zhuǎn)；

所述搖擺為沿垂直于所述細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器中心軸線的平面上的任一方向往復(fù)平移；

所述振蕩為沿平行于所述細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器中心軸線的任一方向往復(fù)平移。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述預(yù)設(shè)的方式為繞偏離所述細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器中心的軸線進(jìn)行偏心回轉(zhuǎn)。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述偏心回轉(zhuǎn)直徑小于所述細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器的半徑，和/或，

所述偏心回轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)速為100~400轉(zhuǎn)/分鐘。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟（1）所述的培養(yǎng)的時(shí)間為24~80小時(shí)；

和/或，步驟（2）所述的培養(yǎng)的時(shí)間為48~110小時(shí)；

和/或，步驟（3）所述的培養(yǎng)的時(shí)間為48~160小時(shí)；

和/或，步驟（4）所述的培養(yǎng)的時(shí)間為48~210小時(shí)。

7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟（1）中，每隔20~24小時(shí)更換培養(yǎng)液一次，所述更換培養(yǎng)液為將全部的培養(yǎng)液更換為與原培養(yǎng)液組成相同的新鮮培養(yǎng)液，步驟（2）、步驟（3）以及步驟（4）中，每隔20~24小時(shí)更換培養(yǎng)液一次，所述更換培養(yǎng)液為將40~60%培養(yǎng)液更換為與原培養(yǎng)液組成相同的新鮮培養(yǎng)液；

或者，步驟（1）中，每隔20~24小時(shí)更換培養(yǎng)液一次，所述更換培養(yǎng)液為將全部的培養(yǎng)液更換為與原培養(yǎng)液組成相同的新鮮培養(yǎng)液，步驟（2）、步驟（3）以及步驟（4）中，采用所述細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器進(jìn)行連續(xù)換液。