[發(fā)明專利]一種利用重組大腸桿菌全細(xì)胞催化合成L-蘋果酸的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110338550.4
• 申請(qǐng)日: 2021-03-30
• 公開（公告）號(hào): CN113061563B
• 公開（公告）日: 2023-03-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 尹龍飛;付永前;羅希;鄭偉龍;孫小龍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 臺(tái)州學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12P7/46;C12N9/88;C12R1/19
• 代理公司: 重慶項(xiàng)乾光宇專利代理事務(wù)所(普通合伙) 50244
• 代理人: 侯玉花

本發(fā)明生物酶合成技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種利用重組大腸桿菌全細(xì)胞催化合成L?蘋果酸的方法。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是富馬酸酶提取的產(chǎn)率低、成本高。本發(fā)明的技術(shù)方案是一種利用重組大腸桿菌合成L?蘋果酸的方法，具體如下：構(gòu)建表達(dá)富馬酸酶基因的大腸桿菌工程菌，液體培養(yǎng)工程菌，加入反應(yīng)底物富馬酸鈉，全細(xì)胞催化直至反應(yīng)完全，收集反應(yīng)液。本申請(qǐng)利用分子生物學(xué)技術(shù)，通過重組大腸桿菌全細(xì)胞，以富馬酸鈉為轉(zhuǎn)化底物生產(chǎn)L?蘋果酸。本發(fā)明方法中L?蘋果酸的產(chǎn)率可達(dá)到95％。本發(fā)明為提高蘋果酸產(chǎn)量的研究提供方向，同時(shí)也為其他有機(jī)酸的研究奠定基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明生物酶合成技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種利用重組大腸桿菌全細(xì)胞催化合成L-蘋果酸的方法。

背景技術(shù)

蘋果酸別名2-羥基丁二酸，是一種十分常見卻又十分重要的天然有機(jī)酸，其電離常數(shù)K1為4.0×10^-4、K2為9×10^-6，是生物體內(nèi)三羧酸循環(huán)成員之一。分子內(nèi)含有一個(gè)不對(duì)稱碳原子，有兩個(gè)對(duì)映體，即L-蘋果酸和D-蘋果酸，分別呈左旋和右旋。在許多領(lǐng)域都有著廣泛的用途，生產(chǎn)蘋果酸的方法有許多，諸如化學(xué)合成法、生物合成法、直接發(fā)酵法(又稱一步發(fā)酵法)、兩步發(fā)酵法、酶轉(zhuǎn)化法、直接抽提法等。其中的化學(xué)合成法因?yàn)楹铣傻氖窍O果酸，其產(chǎn)物很難實(shí)現(xiàn)良好的分離效果，在日后的研究中已經(jīng)被淘汰不用。生物合成法主要采用聯(lián)L-蘋果酸和乳酸及固定化細(xì)胞聯(lián)產(chǎn)L-蘋果酸生產(chǎn)工藝。再有一步發(fā)酵法生產(chǎn)L-蘋果酸由于需要消耗比較大的能源物質(zhì)，也很少有人繼續(xù)采用此方法。之后又有部分國內(nèi)外人士提出使用固定化細(xì)胞和固定化酶法生產(chǎn)L-蘋果酸，并在之后形成了一定規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)，但是人們?nèi)匀话l(fā)現(xiàn)這種方法的產(chǎn)量過低，并且成本偏高。現(xiàn)如今，隨著科學(xué)技術(shù)的日漸發(fā)展，越來越多的人發(fā)現(xiàn)了生物酶這一物質(zhì)的奇特之處，眾所周知，酶具有專一性強(qiáng)，高效的催化效率，以及酶促反應(yīng)的催化環(huán)境相對(duì)較為溫和等特點(diǎn)，有著很好的工業(yè)化應(yīng)用前景，酶轉(zhuǎn)化法省去一系列為保證對(duì)映選擇性或區(qū)域選擇性而使用的繁雜操作步驟，而且由于酶促反應(yīng)環(huán)境的溫和性，解決了以往各種生產(chǎn)方法的條件苛刻性這一問題，國內(nèi)孟津等改進(jìn)傳統(tǒng)酶轉(zhuǎn)化法工藝與國外Efrem等對(duì)傳統(tǒng)裝置進(jìn)行改進(jìn)，使回收率大大提高。且有利于保護(hù)環(huán)境，節(jié)能減排。

目前工業(yè)上生物酶法制備L-蘋果酸的關(guān)鍵酶是富馬酸酶。富馬酸酶，又名延胡索酸酶，作用是催化延胡索酸和蘋果酸之間的相互轉(zhuǎn)化。由于富馬酸酶在生產(chǎn)蘋果酸上起著關(guān)鍵的作用。富馬酸酶在自然界中廣泛存在于產(chǎn)氨短桿菌、脫氮副球菌、黃色短桿菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌以及短乳桿菌等微生物中。雖然富馬酸酶存在廣泛，但是在生物合成富馬酸酶的過程中，仍然遇到存在產(chǎn)率低，成本高的問題，這仍然將成為日后研究蘋果酸轉(zhuǎn)化的重點(diǎn)方向。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是富馬酸酶提取的產(chǎn)率低、成本高。

本發(fā)明的技術(shù)方案是一種利用重組大腸桿菌全細(xì)胞催化合成L-蘋果酸的方法，具體如下：構(gòu)建表達(dá)富馬酸酶基因的大腸桿菌工程菌，液體培養(yǎng)工程菌，離心收集濕菌體細(xì)胞，，加入反應(yīng)底物富馬酸鈉，全細(xì)胞催化至反應(yīng)完全，收集反應(yīng)液。

具體的，所述反應(yīng)溫度為30～40℃。

優(yōu)選的，所述反應(yīng)溫度為35℃。

具體的，所述反應(yīng)pH為7～8。

優(yōu)選的，所述反應(yīng)pH為7。

進(jìn)一步的，所述反應(yīng)時(shí)間為8～12h。

優(yōu)選的，所述反應(yīng)時(shí)間為10h。

具體的，所述反應(yīng)體系中，每10mL轉(zhuǎn)化合成體系中添加0.5～2g富馬酸鈉和0.05～2g濕菌體細(xì)胞。

具體的，所述反應(yīng)體系中，每10mL轉(zhuǎn)化合成體系中添加1g富馬酸鈉和0.1g濕菌體細(xì)胞。

進(jìn)一步的，所述的反應(yīng)體系中還添加有終濃度為50mmoL.L^-1的Ca²⁺或/和終體積分?jǐn)?shù)為0.03％～0.06％的烷基酚聚氧乙烯醚OP。