[發明專利]兩步控溫一鍋法生產萊鮑迪苷D的方法

在審

• 申請號: 202110337058.5
• 申請日: 2021-03-26
• 公開（公告）號: CN113046404A
• 公開（公告）日: 2021-06-29
• 發明（設計）人: 馬媛媛;馬斯遠;汪振洋;魏曉珍;來慶英;洪解放;宋浩
• 申請（專利權）人: 天津大學;中化健康產業發展有限公司
• 主分類號: C12P19/56
• 分類號: C12P19/56;C12P19/18
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司 11385
• 代理人: 沈忠華

本發明公開了一種兩步控溫一鍋法生產萊鮑迪苷D的方法，該方法使用能夠分泌表達糖基轉移酶的工程菌轉化萊鮑迪苷A成為萊鮑迪苷D，其特征在于包括如下步驟：誘導培養階段：溫度在28℃?30℃的條件下，對所述工程菌進行誘導培養；酶促反應階段：溫度在32℃?42℃的條件下，加入萊鮑迪苷A進行酶促反應，遠遠超出了一步法制備萊鮑迪苷A的轉化率上限。

技術領域

本發明涉及一種發明萊鮑迪苷D的生產方法，屬于生物發酵工程領域。

背景技術

公開號為CN 110846363 A的中國發明專利說明書中公開一種生產萊鮑迪苷D的方法，該方法包括如下步驟：(1)構建能分泌表達糖基轉移酶UGT1的重組菌1，所述糖基轉移酶UGT1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；(2)在pH3.5-7.8的培養基中培養重組菌1，得到培養液；(3)在步驟(2)獲得的培養液中加入底物萊鮑迪苷A，加入尿苷二磷酸葡萄糖，硫酸鎂或氯化鎂，甲醇，反應，得到萊鮑迪苷D。其中重組菌1為將糖基轉移酶UGT1基因連接至表達載體后轉入宿主細胞，獲得第一種重組菌1；或將糖基轉移酶UGT1基因通過分子生物學技術整合至宿主細胞的基因組，獲得第二種重組菌1；所述糖基轉移酶UGT1基因的核苷序列如SEQ ID NO.2所示。

該發明專利說明書中公開了一鍋法催化萊鮑迪苷A(RebA)生成萊鮑迪苷D(RebD)的一種方法：取重組巴斯德畢赤酵母菌菌株XE-3(重組菌1)甘油管培養物30μL接種于3mLYPD中預培養至OD600在6。將上述培養物1％接種量(0.25mL)接種至pH＝3.5的25mLBMMY培養基，28℃、250rpm，使初始OD600約為1.0。28℃、250rpm培養2day時進行補料，加入終濃度為0.3g/L的RebA、加入終濃度為0.2mM的尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)，加入終濃度為0.5mM的Mg2+(硫酸鎂)，28℃、250rpm培養，每24小時補加終體積濃度為0.5％的甲醇，測定菌體的OD600。HPLC方法分析樣品的產物RebD的生成水平。根據萊鮑迪苷A濃度變化可計算其轉化率，根據萊鮑迪苷D的生成量可計算其收率。重組菌1培養4天時，底物萊鮑迪苷A轉化率為39.59％，產物萊鮑迪苷D收率為38.85％。

該發明專利說明書還公開了第二種一鍋法催化萊鮑迪苷A(RebA)生成萊鮑迪苷D(RebD)的方法：取重組巴斯德畢赤酵母菌菌株XE-3(重組菌1)甘油管培養物30μL接種于3mLYPD中預培養至OD600在4。將上述培養物1％接種量(0.25mL)接種至pH＝7.8的25mLBMMY培養基，28℃、250rpm，使初始OD600約為1.0。28℃、250rpm；培養0.2day時進行補料，加入終濃度為20g/L的RebA的、加入終濃度為1.5mM的UDPG，加入終濃度為5mM的Mg2+(氯化鎂)，28℃、250rpm培養，每24小時補加終體積濃度為1.5％的甲醇，測定菌體的OD600。HPLC方法分析樣品的產物RebD的生成水平。根據RebA濃度變化可計算其轉化率，根據RebD的生成量可計算其收率。重組菌1培養4天時，底物RebA轉化率為29.10％，產物RebD收率為28.08％。

該發明專利說明書還公開了第三種一鍋法催化萊鮑迪苷A(RebA)生成萊鮑迪苷D(RebD)取重組巴斯德畢赤酵母菌菌株XE-3(重組菌1)甘油管培養物30μL接種于3mLYPD中預培養至OD600在3。將上述培養物1％接種量(0.25mL)接種至pH＝6.5的25mLBMMY培養基，28℃、250rpm，使初始OD600約為1.0。28℃、250rpm培養1day時進行補料，加入終濃度為1g/L的RebA的、加入終濃度為1mM的UDPG，加入終濃度為3mM的Mg2+(硫酸鎂)，28℃、250rpm培養，每24小時補加終體積濃度為1％的甲醇，測定菌體的OD600。HPLC方法分析樣品的產物RebD的生成水平。根據RebA濃度變化可計算其轉化率，根據RebD的生成量可計算其收率。重組菌1培養4天時，底物RebA轉化率為68.97％，產物RebD收率為57.75％。

可見該發明專利說明書中公開的方法的RebA轉化率為沒有超過70％。有因素限制了反應的進行。

參考文獻：