[發明專利]一組條碼接頭以及中通量多重單細胞代表性DNA甲基化建庫和測序方法

在審

• 申請號: 202110336815.7
• 申請日: 2021-03-25
• 公開（公告）號: CN115125624A
• 公開（公告）日: 2022-09-30
• 發明（設計）人: 潘星華;麥麗瑤;練志偉;張裕龍;林獻威;李爽;楊香;彭佳佳
• 申請（專利權）人: 南方醫科大學;廣州處方基因技術有限公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 顏希文

本發明提供了一組含樣品條碼的粘性接頭，用于特異標記不同樣品；每個接頭由短寡核苷酸和長寡核苷酸形成，不同接頭設置獨特的條碼序列；該接頭直接連接限制性酶切的基因組DNA片段末端，用于標記多個單細胞或群體細胞或純化的DNA樣品并可進行其擴增。本發明還提供了同時檢測多個樣品CpG甲基化的方法，簡稱M?scRRBS，及其替代性方法M?scRRAS，采用上述接頭特異標記多個樣品，包括每個樣品的所有DNA片段，再把多個樣品合并，實現多樣品的單管反應，進行后續的轉化、測序文庫構建和測序、各樣品讀數分流解碼及下游分析。本發明的建庫技術與scWGBS和scRRBS方法相比，具有高效率、低成本、操作穩定方便等優勢。

技術領域

本發明涉及DNA測序技術領域，尤其涉及一組條碼接頭以及中通量多重單細胞代表性DNA甲基化建庫和測序方法。

背景技術

甲基化和DNA甲基化研究及其意義：甲基化研究是疾病研究的熱點，與基因表達、表型性狀息息相關。生物體的DNA甲基化是指在DNA甲基轉移酶 (DNA methyltransferase，DMT)的催化下，以s-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)為甲基供體，將甲基轉移到特定堿基上的過程。 DNA甲基化可以發生在腺嘌呤的N-6位、鳥嘌呤的N-7位、胞嘧啶的C-5位等。但在哺乳動物中DNA甲基化主要發生在5'-CpG-3'的C上生成5-甲基胞嘧啶 (5mC)。在哺乳動物中CpG以兩種形式存在：①CpG二核苷酸分散于DNA序列中；②CpG二核苷酸呈現高度聚集狀態，形成CpG島(CpG island)。在哺乳動物正常基因組序列中，70％～90％分散的CpG被甲基化修飾，而CpG島則往往處于非甲基化狀態(除有些特殊區域和基因外)，且CpG島常位于轉錄調控區附近，與56％的人類基因組編碼基因相關，因此對基因轉錄區CpG島甲基化狀態的研究十分重要。

人類基因組序列草圖分析結果表明，人類基因組CpG島約為28890個，大部分染色體每1Mb就有5-15個CpG島，平均值為每Mb含10.5個CpG島。DNA 甲基化與人類發育、分化、衰老和疾病的關系密切，特別是CpG島甲基化所致抑癌基因轉錄失活問題，基因組重復序列的低甲基化導致基因組穩定性下降的問題等。DNA甲基化已經成為表觀遺傳學和表觀基因組學的重要研究內容。

近年來，DNA甲基化特征已成為多種腫瘤診斷和預后的生物標志物。DNA 甲基化的研究為揭示癌癥的發生、發展機制，癌癥組織的細胞異質性，癌癥的早期發現和預后效果評估以及進行癌癥的研究治療提供了可能。除此之外，研究DNA序列中CpG島的甲基化情況對于從表觀水平闡述人類多種疾病的發生發展機理、篩查診斷和治療靶標都有重要意義。

DNA甲基化測序的經典方法：傳統的DNA甲基化研究方法主要有三類： (1)重亞硫酸氫鹽特異轉化(conversion)非甲基化的胞嘧啶(C)和測序(Bisulfite Sequencing,BS)；(2)甲基化或非甲基化C或CpGDNA的特異性結合，例如：甲基化DNA免疫沉淀(MethylatedDNA Immunoprecipitation,MeDIP)或甲基化結合蛋白(MeCP2)的特異結合富集；(3)甲基化DNA對甲基化敏感限制性核酸內切酶的阻斷(Resistance toMethylation-sensitiveRestriction Endonuclease, MRE)。然而，無論是BS、MeDIP，還是MRE，都需要大量的DNA樣品才能保證產出可信的讀數。而BS方法能精準定量且分辨率可達到給出單個堿基的分辨率，是DNA甲基化分析的金標準。哺乳動物群體細胞基因組CpG和CpG島甲基化檢測以全基因組重亞硫酸氫鹽測序(WGBS)和簡化代表性重亞硫酸氫鹽測序(RRBS)等方法應用最廣。