[發明專利]一組條碼接頭以及中通量多重單細胞代表性DNA甲基化建庫和測序方法

在審

• 申請號: 202110336815.7
• 申請日: 2021-03-25
• 公開（公告）號: CN115125624A
• 公開（公告）日: 2022-09-30
• 發明（設計）人: 潘星華;麥麗瑤;練志偉;張裕龍;林獻威;李爽;楊香;彭佳佳
• 申請（專利權）人: 南方醫科大學;廣州處方基因技術有限公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 顏希文

1.一組條碼接頭用于甲基化高通量測序文庫構建，其特征在于，包括末端粘性序列、樣品條碼序列和PCR擴增引物相關序列以及引物，所述條碼接頭旨在捕獲和直接連接并利于多樣品高通量轉化和擴增含粘性末端的基因組DNA片段，而不形成接頭二聚體，用于代表性CpG甲基化測序文庫構建。

2.根據權利要求1所述的一組條碼接頭，其特征在于，所述接頭在條碼序列和PCR引物之間插入為擴增后切除引物預設的IIs類型的限制性內切酶和預設接頭粘性末端相關序列，且所述限制性內切酶酶切后形成3’端突出的1個堿基，而且所述限制性內切酶能夠加熱滅活。

3.根據權利要求2所述的一組條碼接頭，其特征在于，所述引物切除所采用IIs類的限制性內切酶序列為5'GTATCCNNNNNT3'，限制性內切酶酶切后形成3’端突出的1個堿基為T，優選地，所述IIs類的限制性內切酶為BciVI。

4.根據權利要求1所述的一組條碼接頭，其特征在于，所述多個序列不同的條碼接頭均由短寡核苷酸和長寡核苷酸，對短寡核苷酸的Tm值的基本要求是10℃＜Tm＜60℃，優先地14℃＜Tm＜56℃形成，短寡核苷酸和長寡核苷酸經變性后退火形成長短DNA雙鏈接頭，所述雙鏈接頭與長寡核苷酸的3'端相對應的末端為粘性，該末端與M-scRRBS程序富集CG片段的限制性內切酶酶切的DNA片段末端直接互補。

5.根據權利要求1或2任一所述的一組條碼接頭，其特征在于，所述長寡核苷酸從5'端到3'端依次含有部分PCR擴增引物序列、切除引物所需限制性內切酶識別序列和預設接頭粘性末端相關序列、及樣品條碼序列。

6.根據權利要求1或2任一所述的一組條碼接頭，其特征在于，所述短寡核苷酸從5'端到3'端依次含有末端粘性序列和所述條碼序列的互補序列。

7.根據權利要求1-4任一所述的一組條碼接頭，其特征在于，在M-scRRBS程序中富集CG片段的限制性內切酶為MspI酶的情況下，短寡核苷酸的末端粘性突出序列為5'CG，該CG堿基不與長ologo的3'末端互補而形成粘性末端。

8.根據權利要求1所述的一組條碼接頭，其特征在于，所述短寡核苷酸的3'端經具有阻止連接或聚合酶延伸功能的基團修飾，包括但不限于3'ddC(3'雙脫氧胞苷)、3'InverteddT(3'反向dT)、3'C3 spacer(3'C3間臂)、3'Amino(3'氨基)或3'phosphorylation(3'磷酸化)，優選為3'ddC，或優選3'Amino。

9.根據權利要求1-8任一所述的一組條碼接頭，其特征在于，所述短寡核苷酸和長寡核苷酸的每個位置的堿基為A、T、C和G中任意一種，3種2種堿基中任意一種，或特定堿基；其中，所述長寡核苷酸中的胞嘧啶選用甲基化胞嘧啶(5mC)。

10.根據權利要求1-9任一所述的一組條碼接頭，其特征在于，所述條碼序列的堿基個數為2-10個，優選為6個。

11.根據權利要求1-10任一所述的一組條碼接頭，其特征在于，所述多個不同的條碼接頭的條碼序列不同，而一組多個序列不同的條碼接頭的PCR擴增引物序列相同。

12.根據權利要求1-11任一所述的一組條碼接頭和引物，任意2個核苷酸位置之間具有穩定核苷酸而免于被核酸酶降解的修飾，優選地，其接頭5'和/或3'末端及近末端第1-5核苷酸之間予以修飾，更優選地，近末端第1-3核苷酸之間予以修飾，優先地，所述修飾為phosphorothioate(硫代磷酸酯)修飾。

13.根據權利要求1所述的一組條碼接頭，其特征在于，所述樣品可為單細胞、群體細胞或提取純化的DNA。