[發(fā)明專利]胰蛋白酶突變體、其制備方法及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110333251.1
• 申請日: 2021-03-29
• 公開（公告）號: CN113061598B
• 公開（公告）日: 2022-07-15
• 發(fā)明（設計）人: 葛新建;馬麗娜
• 申請（專利權）人: 上海碧云天生物技術有限公司
• 主分類號: C12N9/76
• 分類號: C12N9/76;C07K19/00;C12N15/70;C12N1/21;C12P21/06;C12R1/19
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

本發(fā)明提供了一種胰蛋白酶突變體、其制備方法及其應用。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)豬胰蛋白酶的一些位點與其活性及穩(wěn)定性密切相關，基于此獲得了一類胰蛋白酶突變體，與野生型相比，所述突變體的酶活性及穩(wěn)定性更好。本發(fā)明也提供了所述胰蛋白酶突變體的應用。本發(fā)明也提供了優(yōu)化的表達胰蛋白酶突變體的方法，其產(chǎn)量高、生產(chǎn)成本低、適合規(guī)?；a(chǎn)。

技術領域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，更具體地，本發(fā)明涉及一種胰蛋白酶突變體、其制備方法及其應用。

背景技術

胰蛋白酶是一種廣泛存在于自然界中的絲氨酸蛋白酶，在細菌、真菌和哺乳動物中均有發(fā)現(xiàn)。在哺乳動物中，胰蛋白酶與新陳代謝、消化和凝血密切相關。胰蛋白酶被廣泛應用于皮革、生物技術、醫(yī)藥和食品加工產(chǎn)業(yè)。例如在生物制藥工業(yè)中將單鏈胰島素前體轉化為雙鏈胰島素，在動物細胞培養(yǎng)中消化細胞，以及質(zhì)譜檢測中消化蛋白質(zhì)等。

胰蛋白酶在胰腺中以前酶原(Pretrypsinogen)形式生成，通過N端15個氨基酸組成的疏水信號肽從胰腺中分泌出來，分泌過程中信號肽被切除生成無活性的胰蛋白酶酶原(Trypsinogen)。該胰蛋白酶酶原N端由23個氨基酸組成激活肽，該激活肽被腸激酶(Enterokinase)或胰蛋白酶切除后生成具有活性的胰蛋白酶(Trypsin)。胰蛋白酶可裂解堿性氨基酸(賴氨酸或精氨酸氨)羧基端的肽鍵，如果脯氨酸在裂解位點的羧基一側，則不會發(fā)生裂解，如果酸性氨基酸(谷氨酸或天冬氨酸)在裂解位點的兩側，則水解速度較慢。有活性的胰蛋白酶由223個氨基酸組成，含有6對保守的二硫鍵，三維結構整體呈球狀，由N端和C端各6股反向平行的β片層組成的桶裝結構域組成。胰蛋白酶必須結合Ca²⁺才具有酶活性，其鈣離子結合壞(calcium-binding loop)與Ca²⁺相互作用，Ca²⁺參與胰蛋白酶三維結構的穩(wěn)定，促進其水解底物的酶活性，并保護其免于發(fā)生自降解(autolysis)。其帶負電的S1結合位點疏水口袋，決定了胰蛋白酶對底物P1位點為賴氨酸或精氨酸的特異性。激活后的胰蛋白酶因其三維結構表面存在暴露的賴氨酸或精氨酸易發(fā)生自降解，從單鏈形式的β-胰蛋白酶轉化為內(nèi)部由二硫鍵相連的雙鏈α-胰蛋白酶，進一步的自降解會產(chǎn)生γ、δ、ψ形式的胰蛋白酶乃至碎片。自然條件下的胰蛋白酶主要形式是α-胰蛋白酶，其次是β-胰蛋白酶，α和β-胰蛋白酶的活性、熱穩(wěn)定性不同。

雖然動物胰腺提取的胰蛋白酶產(chǎn)品已被廣泛應用，但是存在生產(chǎn)工藝復雜、胰蛋白酶得率較低、胰蛋白酶活性低或穩(wěn)定性差、胰蛋白酶原激活方式不可控導致的蛋白純度不均一、潛在動物污染等問題。隨著市場對胰蛋白酶質(zhì)量需求的提高，已有利用基因工程技術表達的重組胰蛋白酶產(chǎn)品問世，主要采用絲狀真菌、酵母或大腸桿菌表達系統(tǒng)。利用絲狀真菌表達系統(tǒng)將重組胰蛋白酶分泌到培養(yǎng)基中(見專利WO97/00316)，但是宿主細胞自身產(chǎn)生的蛋白酶易導致重組胰蛋白酶原的激活，從而影響重組胰蛋白酶的產(chǎn)量和純度。利用酵母表達系統(tǒng)將重組胰蛋白酶分泌到培養(yǎng)基中(見專利WO 01/55429)，但其存在篩選穩(wěn)轉株周期長、篩選抗生素昂貴、誘導試劑(甲醇)殘留和不規(guī)則糖基化導致重組蛋白構象不均一等缺陷。利用大腸桿菌表達系統(tǒng)在周質(zhì)空間表達可溶重組胰蛋白酶的產(chǎn)量很低，而通過表達包涵體蛋白進行復性制備的重組胰蛋白酶(見專利CN106754842A)的復性率只有約10％，且在后續(xù)工業(yè)大規(guī)模純化中損失嚴重，純化方法無法區(qū)分錯誤折疊不具有胰蛋白酶活性和正確折疊具有胰蛋白酶活性的蛋白，導致終產(chǎn)品的酶比活較低。

綜上所述，現(xiàn)有重組胰蛋白酶還亟待進一步加以優(yōu)化以提高其性能，同時其表達、純化技術存在包涵體蛋白復性率低、生產(chǎn)耗時長和生產(chǎn)成本高等問題也亟待解決。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種胰蛋白酶突變體、其制備方法及其應用。