[發(fā)明專利]胰蛋白酶突變體、其制備方法及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110333251.1
• 申請(qǐng)日: 2021-03-29
• 公開（公告）號(hào): CN113061598B
• 公開（公告）日: 2022-07-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 葛新建;馬麗娜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海碧云天生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12N9/76
• 分類號(hào): C12N9/76;C07K19/00;C12N15/70;C12N1/21;C12P21/06;C12R1/19
• 代理公司: 上海專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

1.一種胰蛋白酶突變體，其是：

(a) 氨基酸序列選自SEQ ID NO: 7，SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 11的胰蛋白酶突變體；或

(b) 在(a)酶的氨基酸序列的多肽的N或C末端添加標(biāo)簽序列或酶切位點(diǎn)序列，或在其N末端添加信號(hào)肽序列后形成的多肽。

2.一種多核苷酸，所述的多核苷酸編碼權(quán)利要求1所述的胰蛋白酶突變體。

3. 如權(quán)利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ IDNO: 12或其第7-678位序列。

4. 如權(quán)利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ IDNO: 10或其第7-678位序列。

5.一種載體，其含有權(quán)利要求2-4任一所述的多核苷酸。

6.如權(quán)利要求5所述的載體，其特征在于，所述載體還包括編碼SUMO標(biāo)簽和/或His標(biāo)簽的核苷酸序列。

7. 如權(quán)利要求6所述的載體，其特征在于，包括編碼His-SUMO3標(biāo)簽的核苷酸序列，所述His-SUMO3標(biāo)簽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 13所示。

8.如權(quán)利要求7所述的載體，其特征在于，該載體表達(dá)的融合蛋白中，His-SUMO3標(biāo)簽蛋白的C端連接權(quán)利要求1所述的胰蛋白酶突變體。

9.一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其含有權(quán)利要求5-8任一所述的載體，或基因組中整合有權(quán)利要求2-4任一所述的多核苷酸；所述的宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞。

10.如權(quán)利要求9所述的遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞。

11. 一種提高胰蛋白酶的活性或穩(wěn)定性的方法，包括改造SEQ ID NO: 1所示的胰蛋白酶，形成氨基酸序列選自下組的胰蛋白酶突變體：SEQ ID NO: 7，SEQ ID NO: 9或SEQ IDNO: 11。

12.權(quán)利要求1所述的胰蛋白酶突變體的制備方法，該方法包含：

(i) 培養(yǎng)權(quán)利要求9-10任一所述的宿主細(xì)胞；

(ii) 收集含有所述的胰蛋白酶突變體的培養(yǎng)物；

(iii) 從培養(yǎng)物中分離出所述的胰蛋白酶突變體。

13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，當(dāng)胰蛋白酶突變體的核苷酸序列與編碼SUMO標(biāo)簽和/或His標(biāo)簽的核苷酸序列融合表達(dá)、獲得融合蛋白包涵體后，還包括：包涵體變性、復(fù)性、純化的步驟。

14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述的純化步驟中，包括：添加SUMO蛋白水解酶、切割融合蛋白、分離獲得所述胰蛋白酶突變體。

15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述SUMO蛋白水解酶為SUMO特異性蛋白酶2。

16.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，以His-SUMO3標(biāo)簽與所述胰蛋白酶突變體融合表達(dá)，對(duì)獲得的包涵體蛋白進(jìn)行清洗、溶解，之后進(jìn)行復(fù)性。

17. 如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，清洗液包括：10-50mM三羥甲基氨基甲烷pH7.4，0.1-1M NaCl，0.1-1% Triton X-100。

18. 如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，溶解液包括：6-8M尿素，5-50mM 二硫蘇糖醇，10-50mM三羥甲基氨基甲烷pH8.0。