[發(fā)明專利]一種用于修復宮腔粘連的生物組合物及其制備方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202110331876.4
• 申請日: 2021-03-29
• 公開（公告）號: CN113041258A
• 公開（公告）日: 2021-06-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 趙云霞;林樹
• 申請（專利權(quán)）人: 林樹;施琦蓉
• 主分類號: A61K35/28
• 分類號: A61K35/28;A61K9/06;A61P15/00;C12N5/0775
• 代理公司: 泉州市博一專利事務(wù)所(普通合伙) 35213
• 代理人: 洪淵源

1.一種用于修復宮腔粘連的生物組合物，其特征在于：包括ShakeGel^TM3D凝膠液和通過流式、成脂誘導分化、成骨誘導分化、成軟骨誘導分化鑒定的自體脂肪間充質(zhì)干細胞，按體積1：1均勻混合而成。

2.如權(quán)利要求1所述的一種用于修復宮腔粘連的生物組合物，其特征在于：所述自體脂肪間充質(zhì)干細胞從動物腹股溝的白色脂肪組織中提取。

3.一種如權(quán)利要求1所述的用于修復宮腔粘連的生物組合物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）、提取與培養(yǎng)小鼠的自體脂肪間充質(zhì)干細胞；

（2）、對步驟（1）的脂肪間充質(zhì)干細胞進行成骨誘導、成脂誘導分化以及成軟骨誘導分化處理；

（3）、取步驟（2）處理后的脂肪間充質(zhì)干細胞上清培養(yǎng)液進行流式細胞分析；

（4）、在狀態(tài)良好的脂肪間充質(zhì)干細胞加入GFP慢性病毒培養(yǎng)基混合液繼續(xù)培養(yǎng)；

（5）、將ShakeGel^TM3D凝膠液與步驟（4）培養(yǎng)得到的自體脂肪干細胞按體積1：1進行離心混勻，制得生物組合物。

4.如權(quán)利要求3所述的用于修復宮腔粘連的生物組合物的制備方法，其特征在于，所述步驟（1）小鼠自體脂肪間充質(zhì)干細胞的提取和培養(yǎng)過程如下：

1）剝離并收集3-4周齡的雌性小鼠腹股溝脂肪組織，放入裝有提前預熱至37℃KRPbuffer的離心管中；

2）將脂肪組織從KRP buffer轉(zhuǎn)移到細胞培養(yǎng)皿，采用預熱的PBS洗滌兩次，按照體積比4：1放入新的KRP buffer，并將脂肪組織剪碎成小塊；

3）吸取上層脂肪懸浮物加入到新的無菌試管，加入等體積濃度為0.75mg/ml的膠原酶Ⅱ；

4）將無菌試管密封后放入37℃水浴緩慢搖動45分鐘，使脂肪懸浮物消化到分離細胞層懸浮在液體最上層與其它沉淀的組織碎片分開時，加入預熱的PBS，中和膠原酶Ⅱ，終止消化；

5）離心分離脂肪干細胞沉淀，吸棄上層混合液；

6）加入紅細胞裂解液重懸沉淀，裂解10min，再離心摒棄上清液，留下脂肪干細胞沉淀；

7）將脂肪干細胞培養(yǎng)基重懸細胞沉淀鋪在細胞培養(yǎng)皿中。

5.如權(quán)利要求3所述的用于修復宮腔粘連的生物組合物的制備方法，其特征在于，所述步驟（2）脂肪間充質(zhì)干細胞的成骨誘導過程如下：

1）將初代提取出的脂肪間充質(zhì)干細胞置于37℃、5%CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞融合度達到80-90%時，用0.25%Trypsin-0.04%EDTA進行消化；

2）消化后的小鼠脂肪間質(zhì)干細胞接種在預先包被0.1%明膠的六孔板中，每孔加入完全培養(yǎng)基；

3）再將細胞置于37℃、5%CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞融合度達到60%-70%時，將孔內(nèi)完全培養(yǎng)基吸走，向六孔板中加入2 mL C57BL/6小鼠脂肪間質(zhì)干細胞成骨誘導分化完全培養(yǎng)基；

4）每隔3天換用新鮮的C57BL/6小鼠脂肪間充質(zhì)干細胞成骨誘導分化完全培養(yǎng)基；

5）誘導2-4周后用茜素紅染色，并在顯微鏡下觀察成骨染色效果。