[發(fā)明專利]BeSO4

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110331273.4
• 申請(qǐng)日: 2021-03-29
• 公開（公告）號(hào): CN113075323B
• 公開（公告）日: 2022-12-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張朝暉;蔡穎;雷媛娣;徐新云;劉艷萍;鄭凱
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南華大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N30/02
• 分類號(hào): G01N30/02;G01N30/06;G01N30/72;G01N30/88
• 代理公司: 衡陽市科航專利事務(wù)所(普通合伙) 43101
• 代理人: 劉政旺

1.BeSO₄染毒16HBE細(xì)胞差異表達(dá)蛋白檢測(cè)與分析方法，其特征是，步驟如下：

S01、細(xì)胞培養(yǎng)：

取16HBE細(xì)胞，分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別進(jìn)行傳代培養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)組的培養(yǎng)基中額外添加BeSO₄，并調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中的BeSO₄濃度為150ug/ml；對(duì)照組的培養(yǎng)基不添加BeSO₄；48小時(shí)后分別收集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)胞；

S02、樣品制備：

a、將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)胞分別置于離心管中，在每個(gè)離心管中分別加入200ul 8Murea裂解液和3ul蛋白酶抑制劑，待裂解液與細(xì)胞充分接觸后，超聲震蕩使細(xì)胞裂解，離心處理并分別收集每個(gè)離心管中的上清液，上清液中含有細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)；

b、分別測(cè)定實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的上清液中的蛋白質(zhì)濃度，然后分別提取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的上清液，置入不同的超濾管內(nèi)管中，確保每份提取出的樣品中的蛋白質(zhì)含量均為150ug；

S03、蛋白還原處理：

a、在各超濾管內(nèi)管中分別加入10mM的DTT溶液，將各超濾管中的溶液量補(bǔ)足至500ul；再分別將各超濾管進(jìn)行離心處理，離心處理后，丟棄超濾管外管中的溶液；

b、重復(fù)a分步驟至少兩次，使裂解液被DTT充分置換掉；

c、將各超濾管置于37℃的孵育箱中1h，使超濾管內(nèi)管中的蛋白質(zhì)與DTT充分發(fā)生還原反應(yīng)；

S04、蛋白烷基化處理：

a、在各超濾管內(nèi)管中分別加入20mM的IAA溶液，將各超濾管中的溶液量補(bǔ)足至500ul；再分別將各超濾管進(jìn)行離心處理，離心處理后，丟棄超濾管外管中的溶液；

b、重復(fù)a步驟至少兩次，使DTT被IAA充分置換掉；

c、將各超濾管靜置于37℃的孵育箱中避光靜置1h，使超濾管內(nèi)管中的蛋白質(zhì)與IAA充分發(fā)生烷基化反應(yīng)；

S05、蛋白酶解：

a、在各超濾管內(nèi)管中分別加入100mM的TEAB溶液，將各超濾管中的溶液量補(bǔ)足至500ul；再分別將各超濾管進(jìn)行離心處理，離心處理后，丟棄超濾管外管中的溶液；

b、重復(fù)a步驟至少兩次，使IAA被TEAB充分置換掉；

c、將各超濾管內(nèi)管中的溶液分別轉(zhuǎn)移至不同的離心管中，再分別對(duì)各離心管進(jìn)行離心處理，使離心管中的溶液都匯集到離心管的底部；

d、在各離心管中分別加入胰蛋白酶，再將各離心管均置于37℃的孵育箱中進(jìn)行酶解反應(yīng)14-16h；

S06、對(duì)蛋白進(jìn)行TMT標(biāo)記：

a、使用TMT標(biāo)簽對(duì)酶解后的各離心管內(nèi)的樣品進(jìn)行標(biāo)記，每個(gè)樣品使用1個(gè)標(biāo)簽；

b、標(biāo)記完成后，各離心管內(nèi)分別加入8ul的5%羥胺，再將各離心管置于37℃的孵育箱中15min，以終止標(biāo)記反應(yīng)；

S07、對(duì)樣品進(jìn)行LC-MS/MS檢測(cè)：

a、將所有的離心管內(nèi)的溶液混合為一管樣品，再對(duì)混合后的樣品進(jìn)行濃縮干燥，然后加入100ul的0.1%FA溶解干燥濃縮后的樣品，之后對(duì)溶解后的樣品進(jìn)行分餾，獲得45管分餾樣品，將所有的分餾樣品濃縮蒸干以待后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用；

b、將45管濃縮蒸干樣品分別命名為1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)······45號(hào)，在1-15號(hào)濃縮蒸干樣品中分別加入20ul的0.1%FA進(jìn)行溶解，然后用1號(hào)溶液依次溶解16號(hào)和31號(hào)樣品，用2號(hào)溶液依次溶解17號(hào)和32號(hào)樣品，用3號(hào)溶液依次溶解18號(hào)和33號(hào)樣品，以此類推，用15號(hào)溶液依次溶解30號(hào)和45號(hào)樣品，最終得到15管溶液，每管溶液中均包含3管濃縮蒸干樣品的物質(zhì)量；

c、將15管溶液于質(zhì)譜儀進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)，針對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)使用UniProt數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索，獲得包含蛋白種類、豐度信息和相對(duì)分子量的原始數(shù)據(jù)；

S08、GO和KEGG富集分析：

a、按照P value＜0.05的標(biāo)準(zhǔn)，并通過Persue軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選，找到差異表達(dá)蛋白；

b、基于R語言“clusterProfiler”及“org.Hs.eg.db”兩個(gè)軟件包對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行GO富集分析和KEGG富集分析，通過GO富集分析獲取差異表達(dá)蛋白的生物學(xué)功能、分布位置和分子功能，通過KEGG富集分析獲取差異表達(dá)蛋白參與BeSO₄致16HBE細(xì)胞損傷的信號(hào)途徑；

S09、PPI網(wǎng)絡(luò)圖分析：

a、將差異表達(dá)蛋白輸入STRING在線數(shù)據(jù)庫，將檢索結(jié)果保存為TSV格式文件；

b、通過Cytoscape軟件對(duì)TSV格式文件進(jìn)行可視化分析，繪制出上調(diào)差異蛋白組成的PPI網(wǎng)絡(luò)圖和下調(diào)差異蛋白組成的PPI網(wǎng)絡(luò)圖；

c、通過Cytoscape軟件的MCODE插件，分別對(duì)上調(diào)差異蛋白組成的PPI網(wǎng)絡(luò)圖和下調(diào)差異蛋白組成的PPI網(wǎng)絡(luò)圖中的節(jié)點(diǎn)信息進(jìn)行計(jì)算，進(jìn)一步提取出這兩種PPI網(wǎng)絡(luò)圖中的關(guān)鍵蛋白模塊，稱為上調(diào)關(guān)鍵蛋白模塊和下調(diào)關(guān)鍵蛋白模塊；

d、對(duì)上調(diào)關(guān)鍵蛋白模塊和下調(diào)關(guān)鍵蛋白模塊分別作GO富集分析，以獲取上調(diào)關(guān)鍵蛋白模塊和下調(diào)關(guān)鍵蛋白模塊的生物學(xué)功能、分布位置和分子功能；

e、根據(jù)上調(diào)關(guān)鍵蛋白模塊和下調(diào)關(guān)鍵蛋白模塊的生物學(xué)功能篩選出與BeSO₄致16HBE細(xì)胞損傷相關(guān)的關(guān)鍵蛋白；上調(diào)關(guān)鍵蛋白分別為：RIOK2、CSNK1D和HEATR1；下調(diào)關(guān)鍵蛋白分別為：PRDX5、P4HB、GLRX3、PDIA3、PRDX2、TXN、SOD2、CTNNB1和HMGB1。