[發(fā)明專利]BeSO4

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110331273.4
• 申請日: 2021-03-29
• 公開（公告）號: CN113075323B
• 公開（公告）日: 2022-12-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張朝暉;蔡穎;雷媛娣;徐新云;劉艷萍;鄭凱
• 申請（專利權(quán)）人: 南華大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/72;G01N30/88
• 代理公司: 衡陽市科航專利事務(wù)所(普通合伙) 43101
• 代理人: 劉政旺

BeSO₄染毒16HBE細胞差異表達蛋白檢測與分析方法，涉及呼吸系統(tǒng)疾病實驗研究領(lǐng)域，步驟如下：1、細胞培養(yǎng)；2、樣品制備；3、蛋白還原處理；4、蛋白烷基化處理；5、蛋白酶解；6、對蛋白進行TMT標記；7、對樣品進行LC?MS/MS檢測；8、GO和KEGG富集分析；9、PPI網(wǎng)絡(luò)圖分析。本發(fā)明利用TMT標記的定量蛋白質(zhì)組學技術(shù)和生物信息學分析，篩選BeSO₄處理16HBE細胞前后的差異表達蛋白，分析了差異表達蛋白參與的生物學過程及重要信號途徑，并進一步篩選了對后續(xù)研究具有重要參考價值的關(guān)鍵蛋白，為后續(xù)探究BeSO₄致16HBE細胞毒性機制及尋找潛在生物標志物提供了新方向。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及呼吸系統(tǒng)疾病實驗研究領(lǐng)域，特別是一種BeSO₄染毒16HBE細胞差異表達蛋白檢測與分析方法。

背景技術(shù)

鈹(beryllium，Be)是有致癌作用的非放射性元素，近年來隨著經(jīng)濟迅速發(fā)展，鈹應(yīng)用于工業(yè)領(lǐng)域范圍正不斷擴大，包括核工業(yè)、航天工程、信息技術(shù)行業(yè)，是一種嚴重危害職業(yè)人群健康的職業(yè)與環(huán)境毒物。

隨著生產(chǎn)技術(shù)的革新和防護措施的加強，高劑量的鈹暴露逐漸減少，而低劑量的鈹暴露日益成為新的問題。鈹化合物可致急性化學性肺炎、慢性鈹病甚至肺癌，其中慢性鈹病表現(xiàn)為以肺部肉芽腫或肺間質(zhì)纖維化為主的病變。目前，鈹?shù)亩咀饔脵C制尚未完全闡明，鈹病的治療也僅是對癥及支持治療為主。

因此，鈹化合物對健康的危害值得關(guān)注，深入研究鈹化合物的毒作用機制對于防治鈹病顯得尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，而提供一種BeSO₄染毒16HBE細胞差異表達蛋白檢測與分析方法，其從分子領(lǐng)域探索了BeSO₄染毒16HBE細胞的潛在生物標志物，對后續(xù)探究鈹化合物的毒作用機制，以及鈹病的診斷和治療具有指導(dǎo)意義。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：BeSO₄染毒16HBE細胞差異表達蛋白檢測與分析方法，步驟如下：

S01、細胞培養(yǎng)：

取16HBE細胞，分為實驗組和對照組分別進行傳代培養(yǎng)；實驗組的培養(yǎng)基中額外添加BeSO₄，并調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中的BeSO₄濃度為150ug/ml；對照組的培養(yǎng)基不添加BeSO₄；48小時后分別收集實驗組和對照組的細胞；

S02、樣品制備：

a、將實驗組和對照組的細胞分別置于離心管中，在每個離心管中分別加入200ul8M urea裂解液和3ul蛋白酶抑制劑，待裂解液與細胞充分接觸后，超聲震蕩使細胞裂解，離心處理并分別收集每個離心管中的上清液，上清液中含有細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)；

b、分別測定實驗組和對照組的上清液中的蛋白質(zhì)濃度，然后分別提取實驗組和對照組的上清液，置入不同的超濾管內(nèi)管中，確保每份提取出的樣品中的蛋白質(zhì)含量均為150ug；

S03、蛋白還原處理：

a、在各超濾管內(nèi)管中分別加入10mM的DTT溶液，將各超濾管中的溶液量補足至500ul；再分別將各超濾管進行離心處理，離心處理后，丟棄超濾管外管中的溶液；

b、重復(fù)a分步驟至少兩次，使裂解液被DTT充分置換掉；

c、將各超濾管置于37℃的孵育箱中1h，使超濾管內(nèi)管中的蛋白質(zhì)與DTT充分發(fā)生還原反應(yīng)；

S04、蛋白烷基化處理：

a、在各超濾管內(nèi)管中分別加入20mM的IAA溶液，將各超濾管中的溶液量補足至500ul；再分別將各超濾管進行離心處理，離心處理后，丟棄超濾管外管中的溶液；