[發明專利]一種表皮干細胞的分離及培養方法和細胞懸液

在審

• 申請號: 202110330595.7
• 申請日: 2021-03-26
• 公開（公告）號: CN113174365A
• 公開（公告）日: 2021-07-27
• 發明（設計）人: 萬綿水;林創鑫
• 申請（專利權）人: 萬綿水
• 主分類號: C12N5/074
• 分類號: C12N5/074;A61K35/36;A61P17/02
• 代理公司: 深圳市君之泉知識產權代理有限公司 44366
• 代理人: 呂戰竹

本發明涉及一種表皮干細胞的分離及培養方法，包括：取大于或等于預設大小的初始皮片，進行預處理得到第一中間皮片；進行清洗得到第二中間皮片；放入混合消化液中，并置于恒溫搖床進行消化得到第三中間皮片，混合消化液包括胰蛋白酶和乙二胺四乙酸，其中胰蛋白酶的質量體積比為0.5％～1.25％，消化時間為45～90min；取出第三中間皮片，刮取解離細胞；收集解離細胞得到細胞懸液，進行離心，棄上清；利用完全無血清角質形成細胞培養基進行細胞重懸，得到重懸細胞培養液；將重懸細胞培養液置于用人胎盤Ⅳ型膠原鋪板的培養皿中，按照預設時間進行換液，待細胞長滿培養皿的70～80％進行傳代培養。通過所述方法能夠兼顧分離速度和分離比率，且能夠提高細胞增殖能力。

技術領域

本發明涉及組織工程技術領域，具體涉及一種表皮干細胞的分離及培養方法。本發明還涉及該方法制備出的表皮干細胞懸液。

背景技術

創面是正常皮膚(組織)的完整性被破壞以及一定量正常組織丟失后形成的表面。目前臨床上用來覆蓋創面的材料主要有患者自體皮、異體皮或異種皮，另外還有自體表皮細胞培養的表皮。但是，上述各種來源的皮各自均存在明顯不足，如自體皮存在皮源不足的問題，異體皮或異種皮存在排斥反應的問題，培養表皮存在時間長、易感染、費用昂貴、彈性差等問題。故而，基于組織工程技術構建復合型人工皮膚，已成為當代燒傷醫學及組織工程學的一大熱點。

人工皮膚的構建需要分離種子細胞，目前用于分離表皮細胞的較為快速的方法主要是酶消化法。酶消化法主要包括直接消化法和表皮真皮分離法，其中，直接消化法是將皮膚剪碎，然后用酶進行消化，消化完成后進行純化步驟實現表皮細胞和真皮細胞的分離，以獲得表皮細胞；表皮真皮分離法是先用消化液將表皮和真皮分離，然后對表皮進行消化，以獲得表皮細胞。

兩種酶消化法各有優缺點，表皮真皮分離法分離得到的表皮細胞中干細胞比率相對較高，但需過夜消化，從取材到成功分離細胞需一天的時間，消化時間長；直接消化法分離時間短，但在消化后需要進行純化步驟，操作過程繁瑣。

另外，在分離細胞后的培養過程中，需要在培養基中添加重組人表皮生長因子(recombinant human epithelial growth factor，rhEGF)，以刺激細胞增殖，但促進作用是有限的，現有技術很難進一步提高細胞增殖能力。

因此，如何提高表皮干細胞的分離和培養效率成為亟待解決的技術問題。

發明內容

基于上述現狀，本發明的主要目的在于提供一種表皮干細胞的分離及培養方法，以提高表皮干細胞的分離和培養效率。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案如下：

本發明的第一方面提供了一種表皮干細胞的分離及培養方法，包括以下步驟：S100，取大于或等于預設尺寸的初始皮片并進行預處理得到第一中間皮片，預處理包括去除初始皮片的多余皮下脂肪、筋膜及血管；S200，對第一中間皮片進行清洗得到第二中間皮片；S300，將第二中間皮片放入混合消化液中，并置于恒溫搖床進行消化得到第三中間皮片，混合消化液包括胰蛋白酶和乙二胺四乙酸，其中胰蛋白酶的質量體積比為0.5％～1.25％，消化時間為45～90min；S400，取出第三中間皮片，并將第三中間皮片置于乳酸林格氏液培養皿中，第三中間皮片的表皮背離乳酸林格氏液培養皿的底部，由上至下刮取解離細胞，解離細胞包括表皮細胞和真皮細胞；S500，收集解離細胞并分散于乳酸林格氏液培養皿中，得到細胞懸液，對細胞懸液進行離心處理，棄上清，保留沉淀的解離細胞；S600，將沉淀的解離細胞置置于完全無血清角質形成細胞培養基中進行重懸，得到重懸細胞培養液；S700，將重懸細胞培養液置于預先用人胎盤Ⅳ型膠原鋪板的培養皿中，按照預設時間進行換液處理，待細胞長至培養皿的70～80％進行傳代培養。

優選地，在步驟S300中，混合消化液中的胰蛋白酶的質量體積比為0.75％～1.0％，所述消化時間為60～75min。進一步優選為混合消化液中的胰蛋白酶的質量體積比為1％，乙二胺四乙酸的質量體積比為0.1％，恒溫搖床的溫度為37℃，消化時間為1h。