[發明專利]一種表皮干細胞的分離及培養方法和細胞懸液

在審

• 申請號: 202110330595.7
• 申請日: 2021-03-26
• 公開（公告）號: CN113174365A
• 公開（公告）日: 2021-07-27
• 發明（設計）人: 萬綿水;林創鑫
• 申請（專利權）人: 萬綿水
• 主分類號: C12N5/074
• 分類號: C12N5/074;A61K35/36;A61P17/02
• 代理公司: 深圳市君之泉知識產權代理有限公司 44366
• 代理人: 呂戰竹

1.一種表皮干細胞的分離及培養方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

S100，取大于或等于預設尺寸的初始皮片并進行預處理得到第一中間皮片，所述預處理包括去除所述初始皮片的多余皮下脂肪、筋膜及血管；

S200，對所述第一中間皮片進行清洗得到第二中間皮片；

S300，將所述第二中間皮片放入混合消化液中，并置于恒溫搖床進行消化得到第三中間皮片，所述混合消化液包括胰蛋白酶和乙二胺四乙酸，其中胰蛋白酶的質量體積比為0.5％～1.25％，消化時間為45～90min；

S400，取出所述第三中間皮片，將所述第三中間皮片置于乳酸林格氏液培養皿中，使所述第三中間皮片的表皮背離所述乳酸林格氏液培養皿的底部，由上至下刮取解離細胞，所述解離細胞包括表皮細胞和真皮細胞；

S500，收集所述解離細胞并分散于所述乳酸林格氏液培養皿中，得到細胞懸液，對所述細胞懸液進行離心處理，棄上清，保留沉淀的解離細胞；

S600，將所述沉淀的解離細胞置于完全無血清角質形成細胞培養基中進行重懸，得到重懸細胞培養液；

S700，將所述重懸細胞培養液置于預先用人胎盤Ⅳ型膠原鋪板的培養皿中，按照預設時間進行換液處理，待細胞長至所述培養皿的70～80％進行傳代培養。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟S300中，所述混合消化液中的胰蛋白酶的質量體積比為0.75％～1.0％，所述消化時間為60～75min。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，在步驟S300中，每平方厘米初始皮片添加2-4ml所述混合消化液。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，在步驟S300中，所述恒溫搖床的轉速為80-120rpm。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟S200中所述對所述第一中間皮片進行清洗包括：先用雙抗溶液清洗一次，再用磷酸鹽溶液清洗多次，其中，所述雙抗溶液中，青霉素的濃度為100U/ml，鏈霉素的濃度為0.1mg/ml。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟S100中，所述預設尺寸為大于8cm²。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟S600中，所述完全無血清角質形成細胞培養基為：在基礎無血清角質形成的細胞培養基中添加重組人生長因子、青霉素和鏈霉素。

8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟S700中，每平方厘米鋪板添加1.0-3.0μg的所述人胎盤Ⅳ型膠原。

9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，在步驟S700中，按照預設時間進行換液處理，包括：將所述重懸細胞培養液置于預先用人胎盤Ⅳ型膠原鋪板的培養皿24h后，待細胞貼壁換液一次，之后每2～3天換液一次。

10.一種表皮干細胞懸液，其特征在于，采用如權利要求1～9任一所述的方法制備，用于皮膚創傷愈合。