[發(fā)明專利]一種草木樨毛狀根轉(zhuǎn)化方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110330271.3
• 申請日: 2021-03-29
• 公開（公告）號: CN112795590B
• 公開（公告）日: 2022-11-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張吉宇;王升升;段珍;吳凡
• 申請（專利權(quán)）人: 蘭州大學(xué)
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/06;A01H6/54;A01C1/00;A01C1/08;A01C1/02;A01G22/40
• 代理公司: 廣西中知華譽(yù)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 45140
• 代理人: 吳震輝

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種草木樨毛狀根轉(zhuǎn)化方法。采用該方法建立草木樨毛狀根轉(zhuǎn)化體系，可以在幼苗切根侵染后的兩周左右獲得轉(zhuǎn)基因毛狀根，這比用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系得到轉(zhuǎn)基因植株要更加快速和簡便，獲得的毛狀根的發(fā)生率和轉(zhuǎn)化率分別為78±2％和70.8±4.2％，且超表達(dá)MaROP6的相對平均表達(dá)量為對照的36.87倍。這就表明利用發(fā)根農(nóng)桿菌進(jìn)行草木樨的毛狀根轉(zhuǎn)化可以作為一種草木樨結(jié)瘤基因功能研究的生物技術(shù)手段，并可能將其推廣到包括抗逆機(jī)理研究在內(nèi)的其他領(lǐng)域的發(fā)展，為草木樨基因功能的驗(yàn)證和遺傳選育奠定基礎(chǔ)。

【技術(shù)領(lǐng)域】

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種草木樨毛狀根轉(zhuǎn)化方法。

【背景技術(shù)】

草木樨(Melilotus spp.)是一年生或兩年生的豆科(Leguminosae)草本植物，全世界共有19種，主要分布于歐亞大陸地中海區(qū)域、東歐和亞洲，白花草木樨(M.albus)是該屬最廣泛的栽培種之一。草木樨的適應(yīng)性廣泛，具有較強(qiáng)的抗逆性，其抗鹽和耐寒的能力在主要豆科牧草中尤其突出。草木樨作為栽培面積僅次于紫花苜蓿的優(yōu)良豆科牧草，含有較高的粗蛋白和粗脂肪以及胡蘿卜素和礦物質(zhì)等其他營養(yǎng)元素，是家畜的優(yōu)良飼草。且草木樨?fù)碛邪l(fā)達(dá)的根系，既能夠固定空氣中的氮?dú)?N₂)，改善土壤肥力，又可以保持土壤，防治水土流失。

目前對于草木樨的研究主要集中在栽培技術(shù)研制、化學(xué)成分鑒定、分子標(biāo)記開發(fā)及草木樨屬植物遺傳多樣性評價等方面，但關(guān)于草木樨的突變體和分子機(jī)制方面研究較少，雖然已對草木樨轉(zhuǎn)錄組和miRNAs進(jìn)行了相關(guān)分析，雖然目前也有一些利用根農(nóng)桿菌對草木樨進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化的方法，但是整體來講，轉(zhuǎn)化率低效果不理想，因此限制了對其基因功能的深入研究，雖然目前有關(guān)于。

自20世紀(jì)初，發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)就被發(fā)現(xiàn)能夠誘導(dǎo)某些植物產(chǎn)生毛狀根，其攜帶的Ri質(zhì)粒能夠使被侵染的植物受傷部位長出毛狀根，并產(chǎn)生大量有效的次生代謝產(chǎn)物。ROP6是小GTPases的亞家族ROP基因家族的成員，已經(jīng)證實(shí)該基因正向參與共生固氮信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，本研究以此為基礎(chǔ)，開發(fā)了一套高效的草木樨毛狀根轉(zhuǎn)化體系，該體系的建立為深入研究草木樨的基因功能奠定了基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

鑒于上述內(nèi)容，找出一種高效、高轉(zhuǎn)化率、低耗時的草木樨毛狀根轉(zhuǎn)化方法，能有效促進(jìn)對草木樨功能基因的研究。

一種草木樨毛狀根轉(zhuǎn)化方法，所述方法包括：制備帶有目的基因的發(fā)根農(nóng)桿菌菌膜、制備草木樨幼苗、將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染到草木樨中、浸染培養(yǎng)、培養(yǎng)后幼苗除菌、除菌后對幼苗進(jìn)行發(fā)根處理。

進(jìn)一步的，所述制備草木樨幼苗的方法為：將草木樨種子進(jìn)行滅菌處理后，將種子放入 4℃的冰箱中催化2d，之后放入25℃培養(yǎng)箱中采用交替光處理進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為3d，下胚軸長至不低于5mm時完成草木樨的幼苗制備。

進(jìn)一步的，所述將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染到草木樨中的處理方法包括草木樨切根和侵染兩個步驟，其中，草木樨切根的方法為：用手術(shù)刀在根尖往上5mm處快速切斷，然后放于含有少量無菌水的培養(yǎng)皿培養(yǎng)；侵染方法為：將草木樨的切口端劃過發(fā)根農(nóng)桿菌菌膜蘸取少量農(nóng)桿菌，然后放置于不含抗生素的1/2的MS培養(yǎng)基中，用封口膜封好后，用錫箔紙包住立放在22℃組培室進(jìn)行避光處理，培養(yǎng)3天。

進(jìn)一步的，所述幼苗除菌方法為：在黑暗處理時，將轉(zhuǎn)染后的草木樨取出，將其將放置于含有250mg/L頭孢霉素和250mg/L羧芐青霉素的滅菌水中，在28℃搖床120rpm除菌30min，滅菌水沖洗3遍，將幼苗放入含有250mg/L頭孢霉素和250mg/L羧芐青霉素的1/2MS培養(yǎng)基中，用封口膜封好后，立放在22℃組培室中采用交替光處理進(jìn)行培養(yǎng)5天。

進(jìn)一步的，所述除菌后對幼苗進(jìn)行發(fā)根處理的方法為：將幼苗從固體培養(yǎng)基中移入營養(yǎng)液中，放置在22℃組培室進(jìn)行光交替處理，直至幼苗長出發(fā)根。

進(jìn)一步的，所述交替光處理的方法為：采用16h光照處理，8h黑暗處理。