[發(fā)明專利]一種高靈敏新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測試劑盒及使用方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110329273.0
• 申請日: 2021-03-27
• 公開（公告）號(hào): CN113322348A
• 公開（公告）日: 2021-08-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王升啟;劉琪;劉麗艷;張影;侯廣爭
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 鄭州龍騰盛世專利代理事務(wù)所(普通合伙) 41174
• 代理人: 張強(qiáng)

本發(fā)明公開了一種高靈敏新型冠狀病毒2019?nCoV核酸檢測試劑盒及使用方法，包括ORF1ab基因引物對、N基因引物對、內(nèi)標(biāo)基因引物對及探針組，本發(fā)明以新型冠狀病毒（2019?nCoV）ORF1ab和N基因?yàn)榘袇^(qū)域，設(shè)計(jì)特異性引物及探針，通過檢測熒光信號(hào)的變化，對樣本中的新型冠狀病毒2019?nCoV核酸進(jìn)行定性檢測，由于ORF1ab基因探針、N基因探針的5’端用熒光基團(tuán)FAM修飾后成為單色雙靶檢測體系，并使用高于常規(guī)的大體積體系進(jìn)行擴(kuò)增，在對新型冠狀病毒2019?nCoV核酸檢測時(shí)，檢測靈敏度高，靈敏度高可達(dá)可以到50copies/mL，而且以正常人上皮細(xì)胞中廣泛存在的核糖核酸酶P（RNase P,RNP）基因作為內(nèi)標(biāo)靶基因，對核酸提取和檢測過程進(jìn)行監(jiān)控，避免了假陰、假陽性的產(chǎn)生，因此在市場推廣前景廣闊。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種高靈敏新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測試劑盒及使用方法。

背景技術(shù)

2019-nCoV主要傳播途徑為經(jīng)呼吸道飛沫傳播，以呼吸道分泌物排出體外，經(jīng)口液、噴嚏傳染，亦可通過接觸傳播。感染新冠病毒后潛伏期在3-7天，一般不超過14天，臨床表現(xiàn)以發(fā)熱乏力、干咳為主，鼻塞流涕等上呼吸道癥狀少見，約半數(shù)患者多在一周后出現(xiàn)呼吸困難，嚴(yán)重者進(jìn)展為急性呼吸窘迫綜合征、休克、難以糾正的代謝性酸中毒和凝血功能障礙。

冠狀病毒為單鏈RNA病毒，屬于巢病毒目(Nidovirales)冠狀病毒科(Coronaviridae)，正冠狀病毒亞科(Orthocoronavirinac)，根據(jù)血清型和基因組特點(diǎn)冠狀病毒亞科被分為α、β、γ、δ4個(gè)屬，已知感染人的冠狀病毒有6種，包括α屬的冠狀病毒(HCoV-229E和HCoV-NL63)和β屬的冠狀病毒(HCoV-HKU1、HCoV-OC43、MERS-CoV和SARS-CoV)，2019-nCoV為β屬的新型冠狀病毒。

2019-nCoV具有包膜，顆粒呈圓形或橢圓形，經(jīng)常為多形性，直徑60-140nm。病毒基因組5’端具有甲基化的帽狀結(jié)構(gòu)，3’端具有poly(A)尾，基因組全長約27-32kb，是目前已知RNA病毒中基因組最大的病毒。冠狀病毒全基因組通常含有7個(gè)開放閱讀框，每相鄰兩基因之間存在間隔序列，5’端為非編碼區(qū)帽子結(jié)構(gòu)，3’端為多聚腺苷酸非編碼區(qū)；從5’端起約占據(jù)全基因組的三分之二的ORF1(包含ORF1a和1b)也稱為復(fù)制酶基因，負(fù)責(zé)編碼16個(gè)以上與病毒復(fù)制相關(guān)的非結(jié)構(gòu)蛋白；靠近3’端的4個(gè)開放閱讀框，依次編碼S蛋白(spikeprotein)、E蛋白(envelope protein)、M蛋白(membrane protein)和N蛋白(nucleoprotein)。冠狀病毒S蛋白位于病毒表面形成棒狀結(jié)構(gòu)，是用于分型的主要基因。N蛋白包裹病毒基因組可用作診斷抗原。

各研究機(jī)構(gòu)及生物公司都致力于相關(guān)核酸檢測試劑盒的開發(fā)和生產(chǎn)，經(jīng)過半年多的使用發(fā)現(xiàn)，目前市場上的2019-nCoV核酸檢測試劑盒，患者在早期感染階段存在漏檢情況。“根據(jù)天津疾控中心1月30日公布的新增確診案例情況顯示，天津疾控第28例患者，男，55歲，與本單位多名新型冠狀病毒感染的肺炎患者為密切接觸者。1月19日出現(xiàn)發(fā)熱，1月25日就診于市第四中心醫(yī)院，兩次核酸檢測陰性，予以居家隔離。1月27日再次發(fā)熱，1月28日核酸檢測陰性，1月30日第四次檢測為陽性”。上述案例的出現(xiàn)說明一部分早期感染的患者在體液中病毒載量低，雖然用現(xiàn)有的檢測試劑盒多次檢測結(jié)果為陰性，但是仍然是病毒感染者且具有感染性。而這類患者的漏檢很可能造成周圍人群進(jìn)一步的感染，不利于病毒傳播的控制。申請?zhí)枮?02010160474.8的中國發(fā)明專利，公開了一種新型冠狀病毒N基因核酸檢測試劑盒，采用N基因特異引物和Taqman探針，結(jié)合特異的內(nèi)標(biāo)引物、探針體系監(jiān)控樣本提取、檢測過程，實(shí)現(xiàn)對2019-nCoV N基因的檢測。申請?zhí)枮?02010160162.7的中國發(fā)明專利，公開了一種新型冠狀病毒ORF1ab基因核酸檢測試劑盒用ORF1ab基因特異引物和Taqman探針，結(jié)合特異的內(nèi)標(biāo)引物、探針體系監(jiān)控樣本提取、檢測過程，實(shí)現(xiàn)對2019-nCoV ORF1ab基因的檢測。但上述方法分別對不同靶基因進(jìn)行檢測，而且現(xiàn)有方法的檢測體系小，模板加樣量小，檢測靈敏度不足，因此仍然存在漏檢的問題。