[發明專利]一種高靈敏新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測試劑盒及使用方法

在審

• 申請號: 202110329273.0
• 申請日: 2021-03-27
• 公開（公告）號: CN113322348A
• 公開（公告）日: 2021-08-31
• 發明（設計）人: 王升啟;劉琪;劉麗艷;張影;侯廣爭
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 鄭州龍騰盛世專利代理事務所(普通合伙) 41174
• 代理人: 張強

1.一種高靈敏新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測試劑盒，其特征在于，包括ORF1ab基因引物對、N基因引物對、內標基因引物對及探針組；

所述ORF1ab基因引物對包含SEQ ID NO.1-2所示的ORF1ab基因上游引物、ORF1ab基因下游引物；所述ORF1ab基因上游引物、ORF1ab基因下游引物的濃度分別為0.1-1.5μmol/L；

所述N基因引物對包含SEQ ID NO.4-5所示的N基因上游引物、N基因下游引物；所述N基因上游引物、N基因下游引物的濃度分別為0.1-1.5μmol/L；

所述內標基因引物對包含SEQ ID NO.7-8所示的內標基因上游引物、內標基因下游引物；所述內標基因上游引物、內標基因下游引物的濃度分別為0.10-1.5μmol/L；

所述探針組包括SEQ ID NO.3所示的ORF1ab基因探針、SEQ ID NO.6所示的N基因探針和SEQ ID NO.9所示的內標基因探針；所述ORF1ab基因探針的濃度為0.01-1μmol/L；所述N基因探針的濃度為0.01-1μmol/L；所述內標基因探針的濃度為0.01-1μmol/L；

所述ORF1ab基因探針、N基因探針的5’端用同一種熒光基團修飾；所述內標探針為與ORF1ab基因探針、N基因探針無交叉的人基因組特異性探針，所述內標基因探針的5’端用熒光基團ROX修飾。

2.根據權利要求1所述的高靈敏新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測試劑盒，其特征在于，所述ORF1ab基因探針、N基因探針的5’端均用熒光基團FAM、HEX、VIC、Cy3、Cy5中的一種修飾。

3.根據權利要求1所述的高靈敏新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測試劑盒，其特征在于，還包含dNTP混合物、DNA聚合酶、逆轉錄酶、RT-PCR緩沖液。

4.根據權利要求1所述的高靈敏新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測試劑盒，其特征在于，包括PCR反應液A和PCR反應液B；

所述PCR反應液A包含ORF1ab基因引物對、ORF1ab基因探針、N基因引物對、N基因探針、內標基因引物對、內標基因探針、dNTP混合物和RT-PCR緩沖液；

所述PCR反應液B包含DNA聚合酶、逆轉錄酶。

5.根據權利要求4所述的高靈敏新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測試劑盒，其特征在于，還包括陽性對照，所述陽性對照為含ORF1ab和N基因的假病毒以及人A549或其它人源細胞培養液混合物。

6.根據權利要求4所述的高靈敏新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測試劑盒，其特征在于，還包括陰性對照，所述陰性對照為無核酸酶水。

7.根據權利要求1所述的高靈敏新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測試劑盒，其特征在于：所述ORF1ab基因上游引物、ORF1ab基因下游引物的濃度均為0.4μmol/L，ORF1ab基因探針的濃度為0.12μmol/L。

8.根據權利要求1所述的高靈敏新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測試劑盒，其特征在于：所述N基因上游引物、N基因下游引物的濃度均為0.4μmol/L，N基因探針的濃度為0.12μmol/L。

9.根據權利要求1所述的高靈敏新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測試劑盒，其特征在于：所述內標基因上游引物、內標基因下游引物的濃度均為0.16μmol/L，內標基因探針的濃度為0.08μmol/L。

10.一種如權利要求3所述的高靈敏新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測試劑盒使用方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）配置60μL反應體系：PCR反應液A和PCR反應液B的混合液25μL，35μL模板RNA；

2）混勻后放入放入熒光PCR擴增儀中進行擴增檢測；

3）設定如下循環體系后開始擴增：50℃ 20min，95℃ 3min，95℃ 15s，54℃ 3min，25℃1min共45個循環，擴增結束后判讀結果。