[發明專利]基于飛行時間質譜平臺的rooptag不對稱多重PCR檢測心血管疾病用藥基因的方法

在審

• 申請號: 202110329214.3
• 申請日: 2021-03-27
• 公開（公告）號: CN112813161A
• 公開（公告）日: 2021-05-18
• 發明（設計）人: 李宗飛;潘韻芝;朱國強
• 申請（專利權）人: 蘇州安未生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6858
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.本發明的核酸質譜法整合了Rooptag引物+不對稱多重PCR，通過不對稱多重PCR對病原體耐藥基因進行擴增，提高檢出的靈敏性；無需通過單堿基延伸反應通過對延伸引物進行一個堿基擴增，然后通過區分延伸產物分子質量進行病原體識別；同時，核酸質譜的通量高，一個反應孔最高可實現100重擴增區域均一化的擴增；具有自動化程度高、檢測通量高、特異性好的優點。其特征在于：包括11種基因17個突變位點的檢測試劑，所述11種基因17個突變位點為VKORC1基因c.1173CT和c.-1639GA位點，CYP2C9基因c.430CT和c.1075AC位點；CYP2D6基因c.100CT位點，ADRB1基因c.1165GC位點，ACE基因I/D位點，AGTR1基因c.1166AC位點，MTHFR基因C677T位點，SLCO1B1基因c.388AG和c.521TC位點，APOE基因c.388TC和c.526CT位點，CYP2C19基因c.681GA、c.636GA和c.-806CT位點，ALDH2基因c.1510GA位點。

2.根據權利要求 1所述，11種基因17個突變位點的檢測引物由一種心血管疾病用藥相關基因的基因的野生型抑制性rooptag上游引物，常規野生型引物特異性引物，tag引物以及常規下游引物組合。

3.根據權利要求 2所述，野生型抑制性rooptag上游引物是由3部分序列構成5端MGB修飾，并且和變異位點區域野生型有10-15bp互補，該互補區域覆蓋SNP等變異位點，3端在SNP等變異位點上游3-5bp處，與5端序列存在這2-4bp的重疊，中間為tag區域，根據不同的檢測靶標可以設計不同的tag。

4.根據權利要求3所述，野生型抑制性rooptag上游引物只有在引物5端序列互補模板存在變異時，才會擴增模板，該引物只有在引物5端序列互補模板存在變異時，才會擴增模板，否則野生型抑制性rooptag上游引物不擴增。

5.根據權利要求2所述，常規野生型引物，沒有tag和roop序列只擴增野生型模板。

6.根據權利要求2所述，常規下游引物，在SNP等變異區域5-10bp 處，該引物Tm值比上游引物高10度左右。

7.根據權利要求2所述，本發明PCR反應為2步：前15個循環為指數擴增期，退火溫度為50-55℃，后面15個循壞為下游引物單引物線性擴增，退火溫度為65-70℃。

8.根據權利要求2所述，野生型抑制性rooptag上游引物與常規野生型引物的濃度比在2:1-20:1之間，優選地，野生型抑制性rooptag上游引物與常規野生型引物的濃度比在5:1-10:1之間。

9.根據權利要求1所述,一種檢測心血管疾病用藥基因的試劑盒，其特征在于：所述11種基因17個突變位點的檢測試劑含有SEQ ID NO.1與SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3與SEQIDNO.4，SEQ ID NO.5與SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7與SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.9與SEQIDNO.10，SEQ ID NO.11與SEQ ID NO.12，SEQ ID NO.13與SEQ ID NO.14，SEQ ID NO.15與SEQID NO.16，SEQ ID NO.17與SEQ ID NO.18，SEQ ID NO.19與SEQ ID NO.20，SEQ IDNO.21與SEQ ID NO.22，SEQ ID NO.23與SEQ ID NO.24，SEQ ID NO.25與SEQ ID NO.26，SEQIDNO.27與SEQ ID NO.28，SEQ ID NO.29與SEQ ID NO.30或SEQ ID NO.31，SEQ ID NO.32與SEQ ID NO.33，SEQ ID NO.34所示的引物對。