[發明專利]高效分泌犬細小病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株C68及利用生物反應器對其進行生產的方法

在審

• 申請號: 202110329027.5
• 申請日: 2021-03-27
• 公開（公告）號: CN112852749A
• 公開（公告）日: 2021-05-28
• 發明（設計）人: 任德強;張健;宋新剛;葉陽;張立恒;孫博;麻昌姣;朱傳海;蔣艷茹;韓雪
• 申請（專利權）人: 哈爾濱元亨生物藥業有限公司
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/08;C12R1/91
• 代理公司: 哈爾濱龍科專利代理有限公司 23206
• 代理人: 李智慧

本發明公開了一種高效分泌犬細小病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株C68及利用生物反應器對其進行生產的方法，所述方法包括如下步驟：步驟一、通過有限稀釋法對犬細小病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株進行亞克隆；步驟二、通過血凝抑制方法檢測經亞克隆所得到的不同細胞株的效價，篩選出效價最高的細胞株C68，其保藏編號為：CGMCC No.21903；步驟三、將細胞株C68在生物反應器中進行連續培養或批次培養。本發明通過對犬細小病毒單克隆抗體雜交瘤細胞進行亞克隆篩選，篩選出一株能夠高效分泌抗體的細胞株，并通過生物反應器進行放大培養，收獲的半成品抗體含量高、質量穩定可控，減少了下游濃縮等耗時的步驟。

技術領域

本發明屬于微生物技術領域，涉及一種高效分泌犬細小病毒單克隆抗體雜交瘤細胞及利用生物反應器生產該抗體的方法。

背景技術

犬細小病毒病（CPVD）是由犬細小病毒引起的一種高度接觸性傳染病。該病可引起犬的急性腸炎及心肌炎，各年齡段犬均可感染，幼犬更易感染，且病死率高。該病不僅使犬主人經濟受到損失同時還給心靈帶來創傷，目前該病是養犬業重要的傳染病之一。預防犬細小病毒病的方法主要是接種疫苗，對于患病犬的治療方法主要是給發病早期的犬注射抗犬細小病毒血清或者注射抗犬細小病毒單克隆抗體，同時配合輸液及注射犬的免疫球蛋白或者白蛋白等等，可有效降低該病的病死率。目前，治療犬細小病毒病所用抗CPV免疫血清是由犬或者異源動物所制備，其質量不穩定，生產成本高，并且有攜帶外源病毒的風險，可引起嚴重的生物安全問題；而應用單克隆抗體治療犬細小病毒病，不但能降低上述風險，并且治療效果更佳，但現有的抗CPV單克隆抗體中和效價（抗病毒活性）低，半成品需要進行多倍濃縮后才能制成品，生產成本高、效率低。

發明內容

為了克服犬細小病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株分泌抗體水平低、產品質量不穩定、生產效率低、生產成本高等問題，本發明提供了一種高效分泌犬細小病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株C68及利用生物反應器對其進行生產的方法。本發明通過對犬細小病毒單克隆抗體雜交瘤細胞進行亞克隆篩選，篩選出一株能夠高效分泌抗體的細胞株，并通過生物反應器進行放大培養，收獲的半成品抗體含量高、質量穩定可控，減少了下游濃縮等耗時的步驟。

本發明的目的是通過以下技術方案實現的：

一種高效分泌犬細小病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株C68，其分類命名為雜交瘤細胞（hybridoma），保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC），地址：北京市朝陽區北辰西路1號院中科院微生物研究所，保藏編號為：CGMCC No.21903，保藏日期為2021年2月25日。

一種利用生物反應器生產高效分泌犬細小病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株C68的方法，包括如下步驟：

步驟一、通過有限稀釋法對犬細小病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株進行亞克隆；

步驟二、通過血凝抑制方法檢測經亞克隆所得到的不同細胞株的效價，篩選出效價最高的細胞株C68，其效價為1:2560；

步驟三、將細胞株C68在生物反應器中進行連續培養，培養條件為：溫度為37℃，攪拌轉速為70 rpm，溶氧為40%，pH為6.85，每日收獲抗體2L，可連續收獲100天以上，收獲的抗體效價為1:2560；或者細胞株C68在生物反應器中進行批次培養，批次培養條件為：溫度為37℃，攪拌轉速為70 rpm，溶氧為40%，pH為6.85，在流加第6~7天可全部收獲，收獲的抗體效價為1:2560。

本發明中，所述連續培養和批次培養均包括細胞生長階段（即：培養細胞增殖）和抗體分泌階段兩個階段，具體培養要求如下：

連續培養：種細胞在反應器中培養24小時后，細胞密度約為2.5*106個/ml時，開始進行流加培養，每24小時流進200ml流加培養基，每日從反應器內取樣檢測細胞密度、成活率并通過血凝抑制試驗檢測抗體效價，當效價達到1:2560時（多在流加第6~7天達到），開始收獲細胞懸液，此時開啟反應器的出液管道，將流速設置為每24小時收獲2L，同時進行同流速補液，補液的成分為（基礎培養基：流加培養基=3:1)；