[發明專利]一種Bmi-1-RING1B過表達的血清9型重組腺相關病毒的構建方法及其應用

有效

• 申請號: 202110326877.X
• 申請日: 2021-03-26
• 公開（公告）號: CN113151357B
• 公開（公告）日: 2022-04-12
• 發明（設計）人: 靳建亮;陳海云;周佳雯;王嶸;謝春鳳
• 申請（專利權）人: 南京醫科大學
• 主分類號: C12N15/864
• 分類號: C12N15/864;C12N15/12;C12N15/66;A61K48/00;A61K9/19;A61P9/00
• 代理公司: 南京業騰知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 32321
• 代理人: 李靜

本發明涉及一種Bmi?1?RING1B過表達的血清9型重組腺相關病毒的構建方法，設計合成帶有BamH I和EcoR I兩個酶切位點的Bmi?1和RING1B串聯的序列，擴增后得目的片段，利用BamH I和EcoR I對穿梭質粒pshuttl?CMV和目的片段進行雙酶切，然后連接，得到重組穿梭質粒，將重組穿梭質粒擴增提純后，與pAAV?RC和pHelper質粒一起共轉染293T細胞，培養后收獲細胞，反復凍融離心，即得。該病毒靶向心臟，在心臟細胞內表達Bmi?1?RING1B復合蛋白，直接靶向GATA4，促進GATA4泛素化及選擇性自噬降解，可作為防治病理性心肌細胞肥大的藥物。

技術領域

本發明屬于生物醫藥技術領域，具體涉及一種Bmi-1-RING1B過表達的血清9型重組腺相關病毒的構建方法及其應用。

背景技術

病理性心肌細胞肥大(pathological cardiomyocytes hypertrophy,PCH)是心力衰竭的關鍵風險因素，其受很多因素的調控，尤其是腎素-血管緊張素-醛固酮(RAAS)系統及其主要效應分子血管緊張素II(Ang II)，是多種心血管疾病(如高血壓心臟病、缺血性心臟病、肥厚性心臟病、擴張性心肌病等)的共同病理過程，被認為是引起心力衰竭和死亡的重要獨立危險因素，防治PCH對阻止多種心血管病癥導致心衰有著重要的意義。老年個體心臟中Ang II上調，RAAS系統激活是引起心臟衰老的關鍵機制。衰老相關的病理性心肌細胞肥大(SA-PCH)與RAAS系統活化、心肌纖維化、衰老相關分泌表型(SASP)、心臟功能障礙以及發病率和死亡率增加有關，并且隨著衰老成為全球公共衛生日益突出的問題，防治SA-PCH對治療多種心血管疾病保護老年健康有著重要的意義。

多梳基因家族成員Bmi-1(B cell-specific MLV integration site-1)抑制Ink4a/Arf基因座的轉錄并維持線粒體功能和氧化還原平衡，以防止細胞周期停滯和衰老，Bmi-1基因缺失引起小鼠應激性早衰。我們發現與野生型(WT)同窩小鼠相比，Bmi-1基因敲除(Bmi-1^-/-) 小鼠血漿中的Ang II和醛固酮(ALD)水平升高，表明RAAS系統被活化；先前的研究發現，由Bmi-1和RING1B(即Rnf2)形成的PRC1復合物在組蛋白泛素化中發揮重要作用，有報道稱RING1B能促進p53等非組蛋白泛素化，且Bmi-1明顯促進了RING1B的 E3泛素連接酶的活性。

先前研究認為：GATA4是在胚胎和成年心肌細胞中高表達的鋅指轉錄因子，其轉錄的下游基因包括心鈉素(ANP)、腦鈉素(BNP)和β肌球蛋白重鏈(β-MHC)等心肌肥大相關指標，成年個體GATA4調節的胎兒基因的再激活通常被認為是在RAAS等因素刺激下導致 PCH和心力衰竭的標志。新近報道發現：GATA4蛋白作為一種新型的衰老調節因子，能激活轉錄因子NF-κB來啟動SASP，加速衰老進程。新近研究表明，GATA4蛋白主要通過p62介導的選擇性自噬降解，其抑制作用可阻止衰老進程。我們的研究發現Bmi-1-RING1B復合物與GATA4結合后增加了GATA4泛素化水平，進而被p62介導的選擇性自噬降解，抑制了SA-PCH的發展。

腺相關病毒(adeno-associated virus,AAV)，是微小病毒科依賴病毒屬，病毒顆粒大小約為20～26nm，經過病毒包裝后可以形成攜帶有外源插入基因的腺相關病毒的病毒顆粒。由于腺相關病毒的安全性能好和表達時效長的優點，目前已成為最有前景的基因治療工具。腺相關病毒有多種血清型，不同血清型對不同組織的親和力不同，其中腺相關病毒血清型9對心臟親和力高，目前已經廣泛應用于心臟疾病的靶向基因治療。

傳統的藥物和干預措施僅可部分改善臨床癥狀，探索新的臨床治療方法和策略從而抑制甚至逆轉病理性心肌細胞肥大逐漸成為心血管領域研究的重要方向。通過構建腺相關病毒(血清型9)為載體的Bmi-1-RING1B復合物促進GATA4自噬降解，抑制PCH 和SA-PCH，具有取材方便、易通過大規模培養細胞獲得，腺相關病毒不整合到宿主基因組具有安全可靠性、劑量穩定可控，是治療心血管疾病的一種理想的基因藥物。

發明內容