[發明專利]一種Bmi-1-RING1B過表達的血清9型重組腺相關病毒的構建方法及其應用

有效

• 申請號: 202110326877.X
• 申請日: 2021-03-26
• 公開（公告）號: CN113151357B
• 公開（公告）日: 2022-04-12
• 發明（設計）人: 靳建亮;陳海云;周佳雯;王嶸;謝春鳳
• 申請（專利權）人: 南京醫科大學
• 主分類號: C12N15/864
• 分類號: C12N15/864;C12N15/12;C12N15/66;A61K48/00;A61K9/19;A61P9/00
• 代理公司: 南京業騰知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 32321
• 代理人: 李靜

1.Bmi-1-RING1B過表達的血清9型重組腺相關病毒在制備用于防治病理性心肌細胞肥大的藥物中的用途，所述Bmi-1-RING1B過表達的血清9型重組腺相關病毒的構建方法包括如下步驟：

（1）根據Bmi-1和RING1B的mRNA序列，合成帶有BamH I和EcoR I兩個酶切位點序列的Bmi-1和RING1B串聯的序列，即為Bmi-1-RING1B序列，進行PCR擴增，得到Bmi-1-RING1B目的片段；

（2）將穿梭質粒pshuttl-CMV和Bmi-1-RING1B目的片段各自用限制性內切酶BamH I和EcoR I進行雙酶切，然后將得到的雙酶切反應產物混合，進行DNA連接反應，得到含有Bmi-1-RING1B基因的重組穿梭質粒，對其進行擴增，提純；

（3）將含有Bmi-1-RING1B基因的重組穿梭質粒和含腺相關病毒基因組DNA的pAAV-RC和pHelper質粒共轉染293T細胞，培養后收獲細胞，反復凍融后離心，獲得病毒上清，即為Bmi-1-RING1B過表達的血清9型重組腺相關病毒，提取DNA進行測序鑒定；

步驟（1）中，所述Bmi-1-RING1B的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.如權利要求1所述的用途，其特征在于，步驟（1）中，所述PCR擴增的上游引物和下游引物分別為F引物和R引物，F引物的序列如SEQ ID NO:4所示，R引物的序列如SEQ ID NO:5所示。

3.如權利要求1所述的用途，其特征在于，步驟（2）中，所述擴增方法為：將含有Bmi-1-RING1B基因的重組穿梭質粒與感受態細胞混合后，放入42℃的水浴孵育90秒，再迅速放入冰浴孵育2分鐘，涂板于選擇培養平板上，37℃過夜培養，第二天挑選單克隆菌落，接種于含50mg/ml氨芐青霉素的LB液體培養基，37℃過夜擴增培養；隨后離心裂解菌液，抽提純化質粒。

4.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述藥物還包含藥學上可接受的載體。

5.如權利要求4所述的用途，其特征在于，所述藥學上可接受的載體包括稀釋劑和賦形劑。

6.如權利要求1或2或3或4或5所述的用途，其特征在于，所述藥物的劑型為針劑或凍干粉。