[發(fā)明專利]利用重組庫德畢赤酵母發(fā)酵連續(xù)生產(chǎn)木糖酸和乙醇的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110324899.2
• 申請(qǐng)日: 2021-03-26
• 公開（公告）號(hào): CN112877375A
• 公開（公告）日: 2021-06-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 嵇豪;金立波;孫達(dá);彭仁義;林蘇娥;董夏夢(mèng)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 溫州大學(xué)
• 主分類號(hào): C12P7/58
• 分類號(hào): C12P7/58;C12P7/06;C12N1/19;C12N15/53;C12N15/81;C12R1/84
• 代理公司: 杭州萬合知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 33294
• 代理人: 余冬;萬珠明

本發(fā)明公開了一種利用重組庫德畢赤酵母發(fā)酵連續(xù)生產(chǎn)木糖酸和乙醇的方法，采用庫德畢赤酵母異源表達(dá)新月柄桿菌木糖脫氫酶基因獲得重組庫德畢赤酵母，利用重組庫德畢赤酵母進(jìn)行發(fā)酵，在好氧發(fā)酵階段經(jīng)過36～48小時(shí)后轉(zhuǎn)入?yún)捬醢l(fā)酵階段。本發(fā)明可以極大地提高底物利用率和產(chǎn)品得率，從而減少能耗，降低污染物的排放。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及酵母技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用重組庫德畢赤酵母發(fā)酵連續(xù)生產(chǎn)木糖酸和乙醇的方法。

背景技術(shù)

化石燃料的日益枯竭以及使用所帶來的環(huán)境污染和全球變暖等問題，促使人們尋找可再生能源來滿足日益增長(zhǎng)的能源需求。生物乙醇是目前最常用的可再生能源，可顯著緩解能源短缺，減少二氧化碳排放。目前，生物乙醇生產(chǎn)中使用的碳源主要來自于作物如玉米、甘蔗和小麥，木質(zhì)纖維素和藻類生物質(zhì)。其中，來源豐富且價(jià)格低廉的纖維素材料是最有潛力的生物乙醇生產(chǎn)原料。纖維素材料經(jīng)預(yù)處理后轉(zhuǎn)化為葡萄糖和木糖以及糠醛，乙酸等抑制劑。在傳統(tǒng)的生物乙醇生產(chǎn)中，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)只能將葡萄糖代謝為乙醇，缺乏高效的木糖代謝途徑，且與一些非傳統(tǒng)酵母相比，釀酒酵母對(duì)纖維素水解液中的抑制劑缺乏足夠的耐受性，嚴(yán)重影響生物乙醇的高效生產(chǎn)。解決這一問題的一種可能方案是利用對(duì)抑制劑具有高耐受性的非傳統(tǒng)酵母對(duì)纖維素材料實(shí)現(xiàn)綜合利用。如纖維素水解液中的木糖可用于生產(chǎn)高附加值的木糖酸，同時(shí)實(shí)現(xiàn)連續(xù)的葡萄糖向生物乙醇的轉(zhuǎn)化。庫德畢赤酵母(Pichia kudriavzevii)是一種非傳統(tǒng)微生物，它對(duì)高溫、高糖、乙醇、低pH及纖維素水解抑制劑等具有高耐受性，可用于乙醇及有機(jī)酸的發(fā)酵，被認(rèn)為是一種極具潛力的新型生物技術(shù)宿主。目前，利用重組庫德畢赤酵母發(fā)酵分別生產(chǎn)乙醇和木糖酸已有報(bào)道，基于這些研究上如何利用重組庫德畢赤酵母的多耐受性實(shí)現(xiàn)木糖酸和乙醇的聯(lián)產(chǎn)極大地提高底物利用率和產(chǎn)品得率，從而減少能耗，降低污染物的排放成為了申請(qǐng)人亟待解決的技術(shù)問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于，提供一種利用重組庫德畢赤酵母發(fā)酵連續(xù)生產(chǎn)木糖酸和乙醇的方法。本發(fā)明可以極大地提高底物利用率和產(chǎn)品得率，從而減少能耗，降低污染物的排放。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下：利用重組庫德畢赤酵母發(fā)酵連續(xù)生產(chǎn)木糖酸和乙醇的方法，采用庫德畢赤酵母異源表達(dá)新月柄桿菌木糖脫氫酶基因獲得重組庫德畢赤酵母，利用重組庫德畢赤酵母進(jìn)行發(fā)酵，在好氧發(fā)酵階段經(jīng)過36～48小時(shí)后轉(zhuǎn)入?yún)捬醢l(fā)酵階段。

上述的利用重組庫德畢赤酵母發(fā)酵連續(xù)生產(chǎn)木糖酸和乙醇的方法，所述重組庫德畢赤酵母的種子培養(yǎng)基包括以下質(zhì)量濃度的成分：葡萄糖20g/L、蛋白胨20g/L和酵母抽提物10g/L。

前述的利用重組庫德畢赤酵母發(fā)酵連續(xù)生產(chǎn)木糖酸和乙醇的方法，所述重組庫德畢赤酵母的發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下質(zhì)量濃度的成分：玉米芯水解液1L，甘油5～10g/L，蛋白胨5～20g/L，酵母抽提物2～ 10g/L。

前述的利用重組庫德畢赤酵母發(fā)酵連續(xù)生產(chǎn)木糖酸和乙醇的方法，利用稀酸法對(duì)玉米芯進(jìn)行預(yù)處理獲得未脫毒的玉米芯水解液。

前述的利用重組庫德畢赤酵母發(fā)酵連續(xù)生產(chǎn)木糖酸和乙醇的方法，利用重組庫德畢赤酵母進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，裝液量為50～100mL每 250mL三角瓶，接種量為2～10％，培養(yǎng)溫度為30～37℃，好氧階段的搖床轉(zhuǎn)速為180～250rpm，轉(zhuǎn)入?yún)捬醢l(fā)酵階段時(shí)搖瓶加軟木塞隔絕氧氣，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)為80～120rpm。

前述的利用重組庫德畢赤酵母發(fā)酵連續(xù)生產(chǎn)木糖酸和乙醇的方法，利用重組庫德畢赤酵母進(jìn)行5L發(fā)酵罐分批發(fā)酵時(shí)，裝液量3～ 4L，接種量為5～10％，培養(yǎng)溫度為30～37℃，攪拌速度為300～400 rpm，好氧階段流加100～160g/L葡萄糖通入空氣，通氣量0.2～0.6vvm，轉(zhuǎn)入?yún)捬醢l(fā)酵階段時(shí)流加100～160g/L葡萄糖，通入氮?dú)猓饬?.2～0.4vvm。