[發(fā)明專利]利用重組庫德畢赤酵母發(fā)酵連續(xù)生產(chǎn)木糖酸和乙醇的方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 202110324899.2 | 申請日： | 2021-03-26 |
| 公開（公告）號： | CN112877375A | 公開（公告）日： | 2021-06-01 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 嵇豪;金立波;孫達;彭仁義;林蘇娥;董夏夢 | 申請（專利權(quán)）人： | 溫州大學 |
| 主分類號： | C12P7/58 | 分類號： | C12P7/58;C12P7/06;C12N1/19;C12N15/53;C12N15/81;C12R1/84 |
| 代理公司： | 杭州萬合知識產(chǎn)權(quán)代理事務所(特殊普通合伙) 33294 | 代理人： | 余冬;萬珠明 |
| 地址： | 325006 浙江省溫州市甌海區(qū)甌海*** | 國省代碼： | 浙江;33 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 利用 重組 庫德畢赤 酵母 發(fā)酵 連續(xù)生產(chǎn) 木糖酸 乙醇 方法 | ||
1.利用重組庫德畢赤酵母發(fā)酵連續(xù)生產(chǎn)木糖酸和乙醇的方法，采用庫德畢赤酵母異源表達新月柄桿菌木糖脫氫酶基因獲得重組庫德畢赤酵母，其特征在于：利用重組庫德畢赤酵母進行發(fā)酵，在好氧發(fā)酵階段經(jīng)過36～48小時后轉(zhuǎn)入?yún)捬醢l(fā)酵階段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用重組庫德畢赤酵母發(fā)酵連續(xù)生產(chǎn)木糖酸和乙醇的方法，其特征在于：所述重組庫德畢赤酵母的種子培養(yǎng)基包括以下質(zhì)量濃度的成分：葡萄糖20g/L、蛋白胨20g/L和酵母抽提物10g/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用重組庫德畢赤酵母發(fā)酵連續(xù)生產(chǎn)木糖酸和乙醇的方法，其特征在于：所述重組庫德畢赤酵母的發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下質(zhì)量濃度的成分：玉米芯水解液1L，甘油5～10g/L，蛋白胨5～20g/L，酵母抽提物2～10g/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用重組庫德畢赤酵母發(fā)酵連續(xù)生產(chǎn)木糖酸和乙醇的方法，其特征在于：利用稀酸法對玉米芯進行預處理獲得未脫毒的玉米芯水解液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用重組庫德畢赤酵母發(fā)酵連續(xù)生產(chǎn)木糖酸和乙醇的方法，其特征在于：利用重組庫德畢赤酵母進行搖瓶發(fā)酵，裝液量為50～100mL每250mL三角瓶，接種量為2～10％，培養(yǎng)溫度為30～37℃，好氧階段的搖床轉(zhuǎn)速為180～250rpm，轉(zhuǎn)入?yún)捬醢l(fā)酵階段時搖瓶加軟木塞隔絕氧氣，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)為80～120rpm。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用重組庫德畢赤酵母發(fā)酵連續(xù)生產(chǎn)木糖酸和乙醇的方法，其特征在于：利用重組庫德畢赤酵母進行5L發(fā)酵罐分批發(fā)酵時，裝液量3～4L，接種量為5～10％，培養(yǎng)溫度為30～37℃，攪拌速度為300～400rpm，好氧階段通入空氣，通氣量0.2～0.6vvm，轉(zhuǎn)入?yún)捬醢l(fā)酵階段時流加100～160g/L葡萄糖，通入氮氣，通氣量0.2～0.4vvm。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用重組庫德畢赤酵母發(fā)酵連續(xù)生產(chǎn)木糖酸和乙醇的方法，其特征在于：所述重組庫德畢赤酵母的構(gòu)建是在庫德畢赤酵母中整合表達載體表達經(jīng)密碼子優(yōu)化后的新月柄桿菌木糖脫氫酶基因xylB。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的利用重組庫德畢赤酵母發(fā)酵連續(xù)生產(chǎn)木糖酸和乙醇的方法，其特征在于：所述重組庫德畢赤酵母的構(gòu)建具體如下：
a、利用引物PDC1F和PDC1R，以庫德畢赤酵母基因組DNA為模板擴展獲得的DNA片段并連接入pMD19T載體；所述引物PDC1F和PDC1R分別為CGCGGATCCGCGTTTAAGTGGTGGTTGTA和CGGGGTACCTGGTGAGATTGATGGATTGT；
b、利用引物FPDCF和FPDCR進行反向PCR；所述引物FPDCF和FPDCR分別為ACAGATAAGTACCTAGGGAGATT和TGACATCTGAATGTAAAATGAAC；
c、利用引物1-F和1-R，以pGAPZB為模板擴增獲得博來霉素抗性基因；所述引物1-F和1-R分別為ACACAGCAAAACACAAAAATATGGCCAAGTTGACCAGTGC和TATCGAAATCTAGCCCGCAAATTAAAGCCTTCGAGC；
d、利用引物2-F和2-R，基因組DNA為模板擴展獲得pGAP啟動子；所述引物2-F和2-R分別為TCGAAGGCTTTAATTTGCGGGCTAGATTTCGATAGGAT和GTAGATTGCGGAGGACATTTTTTGTGGTTGTGTTTGTTTGTGT；
e、密碼子優(yōu)化的木糖脫氫酶基因合成并克隆至PUC57質(zhì)粒上；利用引物3-F和3-R，質(zhì)粒DNA為模板擴展基因片段；所述引物3-F和3-R分別為TTACAAAAAATGTCCTCCGCAATCTACCCA和CATTTTACATTCAGA TGTCATTAACGCCAACCAGCATCG；
f、使用ClonExpress Multis One Step Cloning Kit對上述片段進行一步法連接，獲得木糖脫氫酶表達載體pXYLB，利用醋酸鋰法將經(jīng)過酶切的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入庫德畢赤酵母，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布至含180ug/mL Zeocin的YPD平板上后，30℃下培養(yǎng)3d得到重組庫德畢赤酵母轉(zhuǎn)化子。
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