[發(fā)明專利]一種保加利亞乳桿菌乳酸脫氫酶同工酶作用類型的鑒定方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110324144.2
• 申請(qǐng)日: 2021-03-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112961901A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-06-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃艷娜;唐雪明;王金斌;段賽菲;周茂超
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號(hào): C12Q1/32
• 分類號(hào): C12Q1/32;C12N1/21;C12N15/53;C12N15/70;C12N9/04;C12R1/19
• 代理公司: 上海開(kāi)祺知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31114
• 代理人: 張曉敏;費(fèi)開(kāi)逵

一種保加利亞乳桿菌乳酸脫氫酶同工酶作用類型的鑒定方法，構(gòu)建表達(dá)D?乳酸和L?乳酸的乳酸脫氫酶同工酶基因的重組大腸桿菌，進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)發(fā)酵，結(jié)合搖瓶發(fā)酵和乳酸的測(cè)定，檢測(cè)好氧培養(yǎng)及厭氧培養(yǎng)時(shí)重組大腸桿菌的D?乳酸、L?乳酸的生成情況，判斷不同乳酸脫氫酶同工酶是否具有催化活性，該方法能快速、準(zhǔn)確判鑒定保加利亞乳桿菌中不同的乳酸脫氫酶同工酶在乳酸合成中的作用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于酶活性鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種保加利亞乳桿菌乳酸脫氫酶同工酶作用類型的鑒定方法。

背景技術(shù)

乳酸是一種重要的生物基平臺(tái)化合物，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥、化工和環(huán)保等領(lǐng)域。根據(jù)其旋光性的不同可分為D-乳酸和L-乳酸，分別由D-乳酸脫氫酶(D-LDH，EC1.1.1.28)和L-乳酸脫氫酶(L-LDH，EC 1.1.1.27)催化。

乳酸菌細(xì)胞內(nèi)乳酸脫氫酶的立體特異性決定了形成乳酸的立體構(gòu)型，如Lactobacillus delbrueckii、L.bulgaricus、L.jensenii和L.coryniforis發(fā)酵產(chǎn)物以D-乳酸為主，有的菌株含有兩種乳酸脫氫酶或存在乳酸消旋酶，最終形成DL-乳酸。而有些乳酸菌產(chǎn)生的是L-乳酸，當(dāng)L-乳酸積累時(shí)，則誘導(dǎo)產(chǎn)生乳酸消旋酶，該酶將L-乳酸轉(zhuǎn)變?yōu)镈-乳酸，直至平衡。

有研究顯示，改變pH值或營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，D-乳酸或L-乳酸的比例將發(fā)生變化。對(duì)于合成D-乳酸的乳酸菌來(lái)說(shuō)，D-LDHs具有較L-LDHs更高的丙酮酸催化效率。采用D-LDHs或者L-LDHs生物轉(zhuǎn)化丙酮酸可產(chǎn)生有光學(xué)特性的D-乳酸或者L-乳酸。

通過(guò)過(guò)量表達(dá)ldhD或ldhL基因，在合適的宿主中高效表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)相應(yīng)構(gòu)型乳酸產(chǎn)量的提高。楊登峰等(產(chǎn)高純度L-乳酸大腸桿菌基因工程菌的初步研究[J].現(xiàn)代食品科技，2010，26：126-128)在大腸桿菌中過(guò)量表達(dá)來(lái)源于L.rhamnosus的ldhL基因，成功生產(chǎn)獲得純度為99％的L-乳酸； Zhou等(Functional replacement of the Escherichia coli D-(-)-lactate dehydrogenase gene(ldhA)with the L-(+)-lactate dehydrogenase gene(ldhL) from Pediococcus acidilactici[J].Appl Environ Microbiol，2003，69： 2237-2244)通過(guò)將乳酸片球菌Pediococcus acidilactici的L-LDH基因ldhL 替換大腸桿菌中的D-LDH基因ldhA，從而得到的工程菌SZ85可生產(chǎn)得率為95％的高化學(xué)純的L-乳酸。Okano等(Efficient production of optically pure D-Lactic acid from raw corn starch byusing a genetically modified L-Lactate dehydrogenase gene-deficient andα-amylase-secreting Lactobacillus plantarum strain[J].Appl Environ Microbiol,2009,75: 462-467)敲除L.plantarum NCIMB 8826的ldhL基因，表達(dá)來(lái)自牛鏈球菌Streptococcus bovis148的α-淀粉酶基因，得到的工程菌可有效利用淀粉合成高純度的D-乳酸。

然而，對(duì)于保加利亞乳桿菌中不同的乳酸脫氫酶同工酶的作用鑒定，目前尚無(wú)系統(tǒng)研究。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種保加利亞乳桿菌乳酸脫氫酶同工酶作用類型的鑒定方法，通過(guò)構(gòu)建表達(dá)乳酸脫氫酶基因的重組大腸桿菌，判斷有氧和厭氧發(fā)酵時(shí)重組菌的D-乳酸、L-乳酸的生成情況，快速、準(zhǔn)確判鑒定保加利亞乳桿菌中不同的脫氫酶同工酶在乳酸合成中的作用。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種保加利亞乳桿菌乳酸脫氫酶同工酶作用類型的鑒定方法，包括以下步驟：