[發(fā)明專利]一種保加利亞乳桿菌乳酸脫氫酶同工酶作用類型的鑒定方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110324144.2
• 申請日: 2021-03-26
• 公開（公告）號: CN112961901A
• 公開（公告）日: 2021-06-15
• 發(fā)明（設計）人: 黃艷娜;唐雪明;王金斌;段賽菲;周茂超
• 申請（專利權）人: 上海市農業(yè)科學院
• 主分類號: C12Q1/32
• 分類號: C12Q1/32;C12N1/21;C12N15/53;C12N15/70;C12N9/04;C12R1/19
• 代理公司: 上海開祺知識產權代理有限公司 31114
• 代理人: 張曉敏;費開逵

1.一種保加利亞乳桿菌乳酸脫氫酶同工酶作用類型的鑒定方法，包括以下步驟：

1)菌株培養(yǎng)

將保加利亞乳桿菌ATCC11842菌液接種于3～5mL MRS培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)48～72h；

將大腸桿菌BL21(DE3)菌液接種于3～5mL LB培養(yǎng)基中，37℃，180～220r/min培養(yǎng)10～12h，獲得E.coliBL21感受態(tài)細胞；

2)構建重組大腸桿菌

根據Genbank中Lactobacillus bulgaricus ATCC11842 D-乳酸脫氫酶的基因序列l(wèi)db_rs00400、ldb_rs04425和1db_rs03465，L-乳酸脫氫酶的基因序列l(wèi)db0120和ldb0094，分別設計特異性引物，以保加利亞乳桿菌基因組為模板，進行PCR擴增，獲得相應的目的片段；

采用NheI和XhoI限制性內切酶分別對各目的片段及載體pET28a進行雙酶切，膠回收純化后采用T4 DNA連接酶將酶切后的目的片段和線性化載體pET28a進行連接，其中，目的片段與線性化載體pET28a的質量濃度比為1：3～5；將連接產物42℃熱激轉化到E.coliBL21感受態(tài)細胞，復蘇后涂布LB平板，篩選重組大腸桿菌轉化子；

挑單菌落至終濃度為30～50μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)10～12h，進行菌液PCR驗證，測序，獲得重組大腸桿菌；

3)搖瓶發(fā)酵

以空質粒重組菌E.coli/pET28a作對照，對表達D-乳酸脫氫酶和L-乳酸脫氫酶同工酶基因的五種重組大腸桿菌，分別進行好氧培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)；

將重組大腸桿菌種子按照0.5～2％的接種量接種于M9發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別進行好氧發(fā)酵和厭氧發(fā)酵，添加終濃度為0.1～0.5mmol/L IPTG進行誘導；好氧培養(yǎng)時，用紗布包裹培養(yǎng)容器瓶口；厭氧培養(yǎng)時，裝液量接近滿瓶，容器封口培養(yǎng)；

其中，培養(yǎng)菌液中添加終濃度為30～50μg/mL的卡那霉素，35～38℃，180～220r/min，發(fā)酵時間為18～24h，測定菌體濃度OD600，測定D-乳酸和L-乳酸的濃度。

2.根據權利要求1所述保加利亞乳桿菌乳酸脫氫酶同工酶作用類型的鑒定方法，其特征在于，步驟2)中涉及的引物序列如下：

ldb_rs00400基因：

F：5’-CCGCGCTAGCATGACTAAAATTTTTGC-3’；

R：5’-GCTTCTCGAGTTAGCCAACCTTAACTGG-3’；

ldb_rs04425基因：

F：5’-GGCGGCTAGCATGACTAAAATTGCCAT-3’；

R：5’-CACGCTCGAGTTACAGGTTAACGATGCT-3’；

ldb_rs03465基因：

F：5’-ACTAGCTAGCATGTACCTCTTGCGC-3’；

R：5’-CGACCTCGAGTTACTGCTTTTTCGCTAA-3’；

ldb0120基因：

F：5’-CCGAGCTAGCATGAGTAGAAAAGTCC-3’；

R：5’-CGGGCTCGAGTTATCCTAAAGAGTCC-3’；

ldb0094基因：

F：5’-CGGAGCTAGCATGAGAAAAGTAGCAG-3’；

R：5’-CGGTCTCGAGTTATTCCAAGCTGGCC-3’。

3.根據權利要求1所述保加利亞乳桿菌乳酸脫氫酶同工酶作用類型的鑒定方法，其特征在于，步驟2)中，所述PCR擴增條件為：94℃預變性10min；94℃變性30s，52～55℃退火30s，72℃延伸1min，30個循環(huán)；72℃延伸10min，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。