[發(fā)明專利]一種快速判定草莓植株是否感染主要病毒的方法

有效

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• 申請日: 2021-03-26
• 公開（公告）號: CN113073145B
• 公開（公告）日: 2023-06-30
• 發(fā)明（設計）人: 劉偉;樊新萍;史華平;李捷;尚勇進
• 申請（專利權）人: 山西巨鑫偉業(yè)農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司;山西省農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 太原榮信德知識產(chǎn)權代理事務所(特殊普通合伙) 14119
• 代理人: 楊凱;連慧敏

一種快速判定草莓植株是否感染主要病毒的方法，目的是具有準確高效特點，可進行高通量精準檢測；本發(fā)明用基于雙端標記的鎖核酸八聚體熒光探針(Dual?Labeled?LockedNucleic?Acid?Probe)的實時熒光定量核酸酶鏈式反應(qPCR)，以脫氧核糖核酸(DNA)和互補脫氧核糖核酸(cDNA)的混合物為模板，用多對病毒特異引物通過一次qPCR反應判定所檢測的草莓材料中是否被主要病毒感染。

技術領域

本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)種苗繁育和種植生產(chǎn)領域，具體涉及草莓種苗繁育和種植生產(chǎn)過程中的病毒檢測。

背景技術

據(jù)不完全統(tǒng)計，我國草莓栽培面積已達250萬畝，居世界首位。每年生產(chǎn)上需要優(yōu)質(zhì)草莓生產(chǎn)用商品苗200億株以上，經(jīng)濟價值可達160億元。我國每年需原種一代苗10億株以上，經(jīng)濟價值可達30億元，每年需原種苗5000萬株以上。草莓種苗的繁育一般采用營養(yǎng)繁殖方法，通過母株生發(fā)匍匐莖產(chǎn)生子株而擴大數(shù)量，在生產(chǎn)過程中由于無可避免的蟲害，植株會感染和積累病毒，從而影響種苗的質(zhì)量，種苗的質(zhì)量是影響生產(chǎn)和效益的主要因素，無病毒種苗的制備則成為整個草莓產(chǎn)業(yè)的關鍵因素。目前一般采用熱處理后微莖尖組織培養(yǎng)的方法脫除病毒制成原原種苗，然后擴繁形成原種苗，之后進一步擴繁形成生產(chǎn)種。這種方法也稱為三級育苗體系。在此過程中需要病毒檢測，一方面需要保證病毒脫除效果，另一方面也需要監(jiān)測在次一級的種苗擴繁過程中病毒復染情況。檢測方法主要有以下幾種：1、接種指示植物：該方法比較傳統(tǒng)，需要有指示植物，檢測周期長，時間成本高；2、酶聯(lián)免疫法：該方法需要有相應的抗體蛋白，往往存在難以購買或制備的問題；3、PCR法：是聚合酶鏈式反應(Polymerase?Chain?Reaction)的簡稱,可以將幾個或幾十個拷貝數(shù)DNA片段擴增至上百萬份拷貝的方法。該方法通過擴增病毒的特有核酸片段判定病毒的有無，具有快速的特點，是目前比較常用的方法。4、qPCR法：quantitative?PCR,也稱實時定量PCR，用基于熒光染料或熒光探針的qPCR檢測，其原理是熒光染料嵌入DNA的雙鏈中產(chǎn)生熒光，或探針水解后釋放熒光。熒光信號隨PCR擴增產(chǎn)物的增加而增加，通過實時監(jiān)測熒光信號的強弱來判斷目標片段的有無和多少。前者非特異的擴增會產(chǎn)生假陽性，后者因為熒光探針的特異性增強了準確性。目前世界上發(fā)現(xiàn)感染草莓的病毒有二十多種，在我國主要有四種較為普遍并產(chǎn)生危害，包括草莓鑲脈病毒、草莓斑駁病毒、草莓皺縮病毒和草莓輕型黃邊病毒。其中皺縮病毒能單獨引起葉片皺縮，從而在形態(tài)學上比較容易直觀識別，其它三種病毒為潛隱性病毒，即單獨感染沒有明顯癥狀，從形態(tài)學上較難識別，但仍然顯著影響植株的長勢和產(chǎn)量。由于種植條件和管理水平也能顯著影響植株的長勢和產(chǎn)量，在生產(chǎn)過程中無論是判定原因還是確保種苗的無病毒特性，檢測這三種潛隱性病毒都十分必要。我國目前一般采用PCR的方法通過DNA擴增，然后通過電泳顯示目標條帶來判定病毒的有無。該法需要三次PCR反應針對不同的病毒，存在假陽性和假陰性的可能性。在草莓原種苗制備過程中或草莓種植生產(chǎn)過程中，一般情況下，只需要或者最主要的是判定是否被病毒感染，即可決定取舍。本專利所述的快速檢測三種主要草莓病毒的方法，是熒光標記探針而非熒光染料,且探針的序列包含于三種病毒各自的擴增產(chǎn)物的目標序列中，不但極大提高了檢測的準確度和靈敏度，也提高了檢測效率。PCR擴增時在加入三對引物的同時加入這個特異性的共有熒光探針，該探針為雙端標記的八聚體鎖核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團6-FAM和一個淬滅熒光基團BHQ-1。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5’－3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。PCR反應體系中，當標記有熒光基團的羅氏通用探針與模板DNA混合后，隨著反應的進行，逐步完成高溫變性、低溫復性、適溫延伸的熱循環(huán)，并遵守聚合酶鏈反應（PCR）原理，與模板DNA互補配對的羅氏通用探針被聚合酶解離，熒光基團游離釋放到反應體系中，在特定波長光激發(fā)下發(fā)出特定熒光，隨著循環(huán)次數(shù)的增加，被擴增的目的基因片段呈指數(shù)規(guī)律增長，相應的熒光也隨之增強。通過實時檢測隨PCR擴增而發(fā)生變化的熒光信號強度，與正負對照相比較，判斷出模板中目標序列的有無及計算出其相對含量，或得到反應的Ct值，同時通過已知模板濃度的標準品作對照，即可計算出待測標本目的基因片段的拷貝數(shù)。