[發(fā)明專利]一種快速判定草莓植株是否感染主要病毒的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110323539.0
• 申請日: 2021-03-26
• 公開（公告）號: CN113073145B
• 公開（公告）日: 2023-06-30
• 發(fā)明（設計）人: 劉偉;樊新萍;史華平;李捷;尚勇進
• 申請（專利權）人: 山西巨鑫偉業(yè)農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司;山西省農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 太原榮信德知識產(chǎn)權代理事務所(特殊普通合伙) 14119
• 代理人: 楊凱;連慧敏

1.一種快速判定草莓植株是否感染主要病毒的方法，其特征是用基于雙端標記的鎖核酸八聚體熒光探針（Dual-Labeled?Locked?Nucleic?Acid?Probe）的實時熒光定量核酸酶鏈式反應（qPCR），以脫氧核糖核酸（DNA）和互補脫氧核糖核酸（cDNA）的混合物為模板，用多對病毒特異引物通過一次qPCR反應判定所檢測的草莓材料中是否被主要病毒感染；

所述的主要病毒是指中國在草莓種植和生產(chǎn)中常見的三種主要草莓病毒，即鑲脈病毒（Strawberry?vein?banding?virus）、斑駁病毒（Strawberry?mottle?virus）和輕型黃邊病毒（Strawberry?mild?yellow?edge?virus）；通過一次qPCR反應判定所檢測的草莓材料中是否被一種或兩種或三種感染；三種病毒各自的特異引物如下:

用于探測鑲脈病毒（Strawberry?vein?banding?virus）的引物

Fv：gggctcttgtagcaccgata，Rv：cagttcggcttcttttctgg，針對如下目標序列擴增71bp片段：

gggctcttgtagcaccgataaaacaaaactatcatcaccaggccttttccaccagaaaagaagccgaactg；

用于探測斑駁病毒（Strawberry?mottle?virus）的引物Fm：aagattgccgatatggtctca，Rm：ttctaacgatggcgttttca，針對如下目標序列擴增61bp目標片段：aagattgccgatatggtctcaaatttggctggtgatggtcgtgaaaacgccatcgttagaa；

用于探測輕型黃邊病毒的引物Fy：gagcctgatgtcgctcaagt，Ry：taggtacgggggtcctatcc，針對如下目標序列擴增64bp片段：gagcctgatgtcgctcaagtgtatgctggtgatgattctgcccaggataggacccccgtaccta；

所述基于雙端標記的鎖核酸八聚體熒光探針是qPCR反應體系中的探針，為經(jīng)過熒光標記的鎖核酸八聚體，具體是5’-6-FAM-locked?C-locked?A-locked?T-locked?C-locked?A-locked?C-locked?C-locked?A-BHQ-1-3’或5’-6-FAM-locked?T-locked?G-locked?G-locked?T-locked?G-locked?A-locked?T-locked?G-BHQ-1-3’。

2.如權利要求1所述的快速判定草莓植株是否感染主要病毒的方法，其特征是所述草莓材料是用草莓幼葉為材料，提取植物材料及其上所附著的所有微生物包括病毒的總DNA和RNA，并對RNA進行反轉錄合成cDNA，用DNA和cDNA的混合物為模板進行qPCR；提取RNA時不使用DNA水解酶去除殘留的DNA，對RNA進行反轉錄合成cDNA后，溶液中含有DNA和cDNA，以此為模板進行qPCR；模板的質(zhì)量用測試Actin基因的DNA和cDNA確證；由于鑲脈病毒是DNA病毒，可以直接用其DNA為模板，而斑駁病毒和輕型黃邊病毒是RNA病毒，需要其cDNA為模板；為同一PCR反應提供了宏基因組DNA和cDNA模板，并同時加入三種病毒的三對特異引物，這樣可以一次性探測三種病毒；由于三對引物的擴增產(chǎn)物較短，長度全部在60-80個核苷酸，擴增反應相對靈敏；同時由于在PCR反應體系中加入了熒光FAM標記的八聚體鎖核酸探針，增強了核酸擴增產(chǎn)物的特異性；qPCR的擴增反應用熱激活TagDNA聚合酶，此酶在90℃以上被激活，避免低溫下可能引起的非特異擴增從而導致的假陽性。

3.如權利要求2所述的快速判定草莓植株是否感染主要病毒的方法，其特征是提取RNA時不使用DNA水解酶為DNase?I。

4.如權利要求1所述的快速判定草莓植株是否感染主要病毒的方法，其特征是使用商用的熱激活Tag酶qPCR預混液，其中包括了熱激活TagDNA聚合酶、dNTP、鎂離子，以二倍的濃度預配直接使用。