[發明專利]一種基于嵌合P54抗原表位的非洲豬瘟病毒抗體檢測試劑盒及應用

有效

• 申請號: 202110322732.2
• 申請日: 2021-03-25
• 公開（公告）號: CN113045673B
• 公開（公告）日: 2021-11-23
• 發明（設計）人: 黃超華;花群義;曹琛福;吳江;史衛軍;林彥星;林永濤;翁巧玉;曾少靈;楊俊興
• 申請（專利權）人: 深圳海關動植物檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;G01N33/569;G01N33/543
• 代理公司: 北京蕙識同聯專利代理事務所(特殊普通合伙) 11966
• 代理人: 張林

本發明公開一種基于嵌合有非洲豬瘟病毒P54蛋白抗原表位的藍舌病病毒核心樣顆粒的非洲豬瘟病毒P54抗體檢測方法及其試劑盒。本發明以嵌合核心樣顆粒為包被抗原，以類似原始病毒形態更好地呈現抗原表位，同時以抗原表位特異性的單克隆抗體為阻斷酶標抗體，具有更好的特異性和更優的敏感性。本發明安全性高、敏感性好、特異性強、準確度高且操作便捷，與進口試劑盒相比，檢測符合率達100％。

技術領域

本發明屬于生物檢測技術領域，具體涉及一種用于檢測非洲豬瘟病毒P54抗體檢測的阻斷ELISA試劑盒及其應用，適用于非洲豬瘟病毒P54抗體的特異、快速、準確檢測。

背景技術

非洲豬瘟(African Swine Fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African Swine FeverVirus，ASFV)感染引起的烈性、高度傳染性動物傳染病。其急性癥狀以高熱、網狀內皮系統出血及高死亡率為特征。家豬和野豬所有品種及各年齡段均易感。鈍緣蜱屬軟蜱，特別是O.moubata和O.erraticus，是ASFV的貯存媒介和傳播媒介。此前該病僅限于非洲發生，直到上世紀中葉傳到歐洲、南美及加勒比海地區，2007年傳入東歐并逐漸蔓延至俄羅斯西伯利亞地區。2018年8月3日，我國確診首例ASF疫情。隨后該病在全國大范圍暴發，并給我國養豬業帶來巨大沖擊。

ASF是全球養豬行業的“頭號殺手”，強毒株引發的超急性和急性感染死亡率高達100％。由于ASFV復雜的生物學特性，目前尚未有效的商品化疫苗，因此通過血清學方法和病原學方法對ASF疫情進行監測和診斷變得至關重要。由于國內發生的ASF疫情均屬急性或亞急性，感染豬只大多急性死亡，而且采取對密切接觸豬群進行撲殺等防控手段，因此目前國內大多采用普通PCR和熒光PCR等分子生物學方法對ASFV進行檢測，血清學方法應用較少。但隨著時間的推移，ASFV不斷突變，國內ASF疫情也可能發生變化，隱性感染和耐過豬只不斷增多。非洲豬瘟耐過豬有這幾種情況出現：血清抗體陰性或陽性，血液抗原為陰性或陽性，其中血液抗原陰性、血清抗體陽性非洲豬瘟耐過豬會間歇性排毒并導致非洲豬瘟陰性豬感染發病，說明抗原檢測外，進行抗體檢測非常必要。耐過豬和隱性或無癥狀感染豬的識別關鍵指標是抗體檢測。疫苗尚未上市，但仍有養殖者迫切希望疫苗有突破性進展，一旦疫苗免疫后，除了最重要的生產性能指標，最直接體現免疫作用的方式是抗體檢測，這就需要開展ASFV血清學檢測。研究表明，ASFV P54等蛋白具有強抗原性，在感染豬只體內相應的抗體滴度較高，可作為抗原建立相應的血清學檢測方法用于ASFV的抗體或抗原檢測。

目前ASFV血清學檢測方法主要包括間接ELISA和阻斷ELISA。鑒于非洲豬瘟病毒屬于高致病烈性豬傳染病病毒，我國法定一類傳染病病毒，按照生物安全管理要求，除農村農業部認可的實驗室外，其他實驗室不得操作涉及非洲豬瘟病毒分離等實驗，因此商品化ELISA試劑盒都是以原核或真核表達的ASFV單個蛋白或多個蛋白包被酶標板，其敏感性和特異性在檢測非洲豬瘟病毒抗體水平上有一定的局限性。

本發明是通過將ASFV P54蛋白抗原表位嵌合入藍舌病病毒核心樣顆粒，以近似病毒結構的形式充分展示ASFV P54蛋白抗原表位，并以該嵌合藍舌病病毒核心樣顆粒為包被抗原，以針對該ASFV P54蛋白抗原表位的單克隆抗體為阻斷抗體，從而建立用于檢測非洲豬瘟病毒P54抗體的阻斷ELISA試劑盒，具有很好的特異性和敏感性。

有鑒于此，提出本發明。

發明內容

本發明的目的在于尋求一種安全性高、敏感性好、特異性強、能夠快速、簡便地檢測非洲豬瘟病毒P54抗體的阻斷ELSIA試劑盒。

該試劑盒的優點之一是使用了以嵌合有非洲豬瘟病毒P54抗原表位的藍舌病病毒核心樣顆粒為包被抗原，提高了檢測的敏感性和特異性。

為實現上述目的，本發明首先提供一種嵌合P54蛋白抗原表位的重組藍舌病病毒VP7蛋白，所述VP7蛋白的47-51位柔性序列被替換為EDIQFINPYQ；