[發明專利]一種檢測漢灘型漢坦病毒的試劑盒及其檢測方法

在審

• 申請號: 202110317175.5
• 申請日: 2021-03-25
• 公開（公告）號: CN112981007A
• 公開（公告）日: 2021-06-18
• 發明（設計）人: 張曉龍;慈穎;梁慧杰;劉瑩瑩;李穎;曹曉梅;馮進;楊艷
• 申請（專利權）人: 中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京華科聯合專利事務所(普通合伙) 11130
• 代理人: 王為

本發明涉及一種檢測漢灘型漢坦病毒的試劑盒及其檢測方法，所述試劑盒含有一種用于漢灘型漢坦病毒檢測和分型的引物，其針對漢灘型L基因片段、漢灘型S基因片段、漢灘型M基因片段設計引物，每種型涉及兩個靶點探針組和一個內標探針組。

技術領域

本發明屬于醫藥生物領域，涉及一種檢測病毒的檢測，特別涉及漢灘型漢坦病毒的檢測和鑒定。

背景技術

漢坦病毒(Hantavirus,HV)屬布尼亞病毒科漢坦病毒屬，是一種分節段的、單股、負鏈RNA病毒，其基因組由S(small)、M(medium)和L(large)三個片段組成。到目前為止，全世界已確定有23種漢坦病毒的血清型存在，且不同的漢坦病毒在致病性、疾病譜以及自然攜帶宿主上都各不相同。該病毒在臨床上主要引起歐亞地區的腎綜合征出血熱(Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome,HFRS)和美洲的漢坦病毒肺綜合征(Hantavirus Pulmonary Syndrome,HPS)。

我國是腎綜合征出血熱的高發國家，每年報告發病人數在2-5萬，占世界該病總數的90％以上。長期以來，漢灘型(Hantaan,HTNV)和漢城型(Seoul,SEOV)病毒是存在于我國的兩個主要血清型，其宿主分別為黑線姬鼠(Apodemusagrarius)和褐家鼠(Rattusnorvegicus)。至2003年，在東北棕背中發現普馬拉型漢坦病毒的存在；2007年，證實我國東北地區大林姬鼠攜帶Amur漢坦病毒，中國檢科院于2009年亦在長白口岸鼠類證實Amur漢坦病毒的存在。

2019年我國北部重點口岸監測的鼠類動物自然感染病原體檢測中，從葫蘆島口岸捕獲的褐家鼠中檢出腎綜合征出血熱病原體漢坦病毒核酸陽性4例(4/31)，均為漢城型病毒，帶毒率為12.90％；從長白口岸的大林姬鼠肺組織檢測出漢坦病毒核酸陽性5例(5/54)，為Amur型漢坦病毒，在大林姬鼠中漢坦病毒的帶毒率為9.26％。

葫蘆島口岸2017、2018和2019年均從褐家鼠體內檢測到漢城型漢坦病毒陽性。而病毒可通過宿主動物的血液、唾液、尿液及糞便排出，傳播途徑廣泛，除加強鼠類密度監測外，還應對鼠攜帶病原體進行精準分型檢測，以降低腎綜合征出血熱的傳播風險。

目前漢坦病毒的檢測方法主要有血清學檢測方法(抗原檢測、抗體檢測)和核酸檢測檢測方法，包括免疫熒光法(IFA)、酶聯免疫法(ELISA)、膠體金法、實時熒光RT-PCR法等。

免疫熒光法(IFA)是現行監測方案中推薦的宿主動物中漢坦病毒監測的方法，操作簡便，但結果判斷易受主觀性因素影響，且存在不能用于高通量檢測等問題；酶聯免疫法具有較高的靈敏度，操作簡單，適合高通量檢測，便于臨床日常檢測與大規模的血清學流行病調查，但是其對漢坦病毒型別的判定存在不足；膠體金法具有簡便、廉價等優點，適于基層單位和現場檢測，但靈敏度低，只能定性，不能定量檢測；RT-PCR法，具有高特異性、高靈敏度的優點，可以進行定量檢測，并可進行型別判斷，但其分析結果嚴重依賴循環閾值(Ct值)，無法準確檢測低豐度樣本。

本發明采用的數字PCR技術不依賴標準曲線和擴增循環閾值，可直接定量檢測核酸，屬于終點檢測，某些程度上，擴增不會造成定量的偏倚，對PCR抑制劑更為耐受，在改善定量分析準確性和變異性上有較大優勢；對于核酸含量極低的樣品，檢測靈敏度更高；并且通過微滴閱讀和數據分析軟件，可使微滴質控實現可視化，與RT-PCR法相比，更容易判斷并剔除假陽性，提高了檢測的準確性。

發明內容

本發明的目的在于提供一種用于漢灘型漢坦病毒檢測和分型的引物。針對漢灘型L基因片段、漢灘型S基因片段、漢灘型M基因片段設計引物，每種型涉及兩個靶點探針組和一個內標探針組。

本發明的目的在于提供一種用于漢灘型漢坦病毒檢測和分型的引物，包括以下引物組：