[發(fā)明專利]一種制備重組金黃色葡萄球菌疫苗的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110315359.8
• 申請(qǐng)日: 2021-03-24
• 公開（公告）號(hào): CN113069538B
• 公開（公告）日: 2023-05-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳克平;樊釩;劉冬;朱沖;張仁懷;高婧;杜洪波;楊鑒芹;江之永;吳畏;陳傳鳳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 成都?xì)W林生物科技股份有限公司
• 主分類號(hào): A61K39/085
• 分類號(hào): A61K39/085;A61P31/04;A61P11/00;C07K14/31;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/20;C07K1/18
• 代理公司: 成都金英專利代理事務(wù)所(普通合伙) 51218
• 代理人: 袁英

本發(fā)明提供了一種制備重組金黃色葡萄球菌疫苗的方法，解決了現(xiàn)有技術(shù)中制備重組金黃色葡萄球菌疫苗時(shí)，抗原蛋白純化工藝在放大過程中出現(xiàn)純化收率低，蛋白收獲量少的技術(shù)問題。它包括下述步驟：S1、將疫苗抗原組分HI蛋白原液、SpA5蛋白原液、mSEB蛋白原液及MntC蛋白原液混合，得到蛋白原液混合液；S2、將蛋白原液混合液稀釋；S3、稀釋磷酸鋁溶液，得到佐劑稀釋液；S4、將蛋白原液稀釋液和佐劑稀釋液混合，在室溫密閉吸附后得到疫苗半成品；S5、將步驟S4得到的半成品檢測合格后進(jìn)行成品分裝和包裝。本發(fā)明提供的制備重組金黃色葡萄球菌疫苗的方法，在制備重組金黃色葡萄球菌疫苗時(shí)，抗原蛋白純化工藝在放大過程中純化收率高，蛋白收獲量高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種制備重組金黃色葡萄球菌疫苗的方法。

背景技術(shù)

HI蛋白，金葡菌Hla是細(xì)菌pore-forming?barrel毒素家族最主要的成員，分子量大小為30kD，是金葡菌感染的最主要的致病因子。Hla是一種外毒素，通常由致病性金葡菌特別是MRSA產(chǎn)生。其可通過促使中性粒細(xì)胞裂解，以及對(duì)上皮細(xì)胞的損害而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，引起菌血癥等臨床癥狀。Hla缺失的突變株在侵入性感染動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中毒力減弱，致病作用減小。Wardenburg等構(gòu)建了無毒的缺乏裂解細(xì)胞活性的突變體Hla(H35L)，免疫小鼠后誘導(dǎo)產(chǎn)生了高效價(jià)的保護(hù)性抗體，能夠有效中和Hla，從而降低了金葡菌感染后的致死率。表明無裂解特性的無毒Hla突變體可以作為金葡菌疫苗的候選抗原分子。

SpA5抗原蛋白，金葡菌臨床分離株均表達(dá)SpA，表明SpA為一種高度保守的抗原成分。其分子量為55kDa，分布在細(xì)胞壁表面。成熟肽的N端包含5個(gè)56-61氨基酸殘基的Ig結(jié)合結(jié)構(gòu)域，卷曲成三個(gè)alpha螺旋束。該結(jié)構(gòu)域能結(jié)合于哺乳動(dòng)物IgG，從而抑制宿主調(diào)理吞噬作用。亦能與VH3型的B細(xì)胞受體結(jié)合，使B細(xì)胞凋亡而破壞獲得性及天然免疫應(yīng)答。

在金葡菌感染的膿毒性關(guān)節(jié)炎、敗血癥和皮膚膿腫的小鼠模型中，SpA缺陷突變的金葡菌毒力降低，其原因認(rèn)為是與IgG-Fc結(jié)合的SpA減少，降低了金葡菌的抗吞噬作用。SpA抗吞噬作用的機(jī)制可能為：①SpA與IgG結(jié)合消耗了免疫球蛋白，致使其與吞噬細(xì)胞Fc受體的結(jié)合減少，降低IgG的調(diào)理作用；②葡萄球菌外包被了IgG，在空間上阻止了吞噬細(xì)胞與葡萄球菌的接觸及吞噬作用。

SpA是一個(gè)能和多種宿主成分起作用的多能毒力因子。SpA的Fc結(jié)合區(qū)域也能與TNFR1結(jié)合，發(fā)揮腫瘤壞死因子(TNF)樣作用，啟動(dòng)TNF信號(hào)級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，發(fā)揮促炎效應(yīng)，這是葡萄球菌性肺炎致病的關(guān)鍵。

SpA可以在IgG存在情況下與血管性假血友病因子(vonWillebrand?factor，vWF)結(jié)合。vWF是止血過程中一個(gè)關(guān)鍵因子，遺傳性vWF缺陷可導(dǎo)致嚴(yán)重出血的血友病癥狀。vWF的主要功能是捕捉血循環(huán)中的血小板，并將其固定在血管損傷處，同時(shí)刺激血凝塊的形成。SpA也可通過Spa-gC1qR/p33直接與血小板結(jié)合。SpA是一種黏附因子，其與血小板結(jié)合有助于金葡菌在血管內(nèi)損傷處定植，在血管內(nèi)感染和感染性心內(nèi)膜炎的發(fā)生過程中起重要作用。

MntC抗原蛋白，金葡菌的生存需要多種金屬離子，它們參與多種生化過程，如新陳代謝，DNA合成和毒力因子的監(jiān)管等。這些離子的代謝需要特定功能蛋白的支撐，若通過疫苗產(chǎn)生針對(duì)特定蛋白的抗體阻斷其功能，就可抑制金葡菌的代謝與生長。

錳離子代謝相關(guān)蛋白主要包括一個(gè)ATP合成蛋白MntA、一個(gè)完整的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MntB和一個(gè)錳離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MntC。其中錳離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白C(MntC)是一個(gè)高度保守的細(xì)胞表面蛋白，最新的MntC結(jié)構(gòu)研究結(jié)果顯示，MntC蛋白具有經(jīng)典的雙結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，每個(gè)結(jié)構(gòu)域由α螺旋之間“夾心”四股β鏈組成，其兩個(gè)結(jié)構(gòu)域通過一個(gè)長鏈8倍螺旋和緊附在兩個(gè)結(jié)構(gòu)域表面的金屬結(jié)合位點(diǎn)相連，MntC同源的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域由一個(gè)長的α-螺旋作為骨架蛋白支撐，使得其結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，不易突變，進(jìn)而形成高度保守的序列。