[發明專利]一種納米孔全長轉錄組文庫構建方法

在審

• 申請號: 202110313236.0
• 申請日: 2021-03-24
• 公開（公告）號: CN113046416A
• 公開（公告）日: 2021-06-29
• 發明（設計）人: 鄭洪坤;劉敏;張夢龍;陳鈺萌;駱晨;趙國瑞
• 申請（專利權）人: 北京百邁客生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12N15/10;C40B50/06;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 商秀玲

本發明涉及轉錄組測序技術領域，具體涉及一種納米孔全長轉錄組文庫構建方法。本發明的文庫構建方法包括：將mRNA富集后，采用SMART技術將mRNA反轉錄制備cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增，將PCR擴增產物進行FFPE和末端修復，再連接納米孔測序接頭。該方法利用SMART技術構建全長轉錄組文庫，文庫可用于納米孔測序，對于讀長沒有上限的限制，不需要進行長度選擇，無需拼接，整個轉錄本可以進行單讀長的端到端測序，可實現簡單、準確的組裝，并能區分高度相似的異構體、識別新轉錄本以及檢測融合。

技術領域

本發明涉及轉錄組測序技術領域，具體涉及一種納米孔全長轉錄組文庫構建方法。

背景技術

真核細胞的mRNA的3’末端都帶有一段PolyA，這是利用逆轉錄酶制備cDNA文庫的基礎。但是，由于cDNA的5’末端序列各不相同，獲得cDNA全長序列存在較大的困難，SMART(Switching Mechanism At 5’end of the RNA Transcript)技術的出現解決了該問題。SMART(Switching Mechanism at 5’End of RNA Template)技術的原理是在合成cDNA的反應中事先加入3’末端帶Oligo(dG)的SMART引物，由于逆轉錄酶以mRNA為模板合成cDNA，在到達mRNA的5’末端時遇到真核mRNA特有的帽子結構，即甲基化的G時會連續在合成的cDNA末端加上幾個C，SMART引物的Oligo(dG)與合成cDNA末端突出的幾個C配對后形成cDNA的延伸模板，逆轉錄酶會自動轉換模板，以SMART引物作為延伸模板繼續延伸cDNA單鏈直到引物的末端，這樣得到的所有cDNA單鏈的一端有含Oligo(dT)的起始引物序列，另一端有已知的SMART引物序列，合成第二鏈后可以利用通用引物進行擴增。由于具有5’帽子結構的mRNA才能利用這個反應得到能擴增的cDNA，因此擴增得到的cDNA就是全長cDNA。

轉錄組是給定細胞中存在的所有RNA分子的集合，可以通過高通量技術來確定，例如微陣列分析或RNA測序(RNA-seq)方法。使用NGS技術，RNA-seq已取代微陣列分析，因為前者可以檢測到新的或未知的轉錄本。此外，與微陣列相比，NGS能夠以更高的表達水平動態范圍進行轉錄組分析。隨著樣品制備方法的改進和測序成本的降低，NGS的RNA seq已成為分析轉錄組的首選方法。大多數NGS平臺生成的單個reads的長度范圍從35nt到大約500nt，因此單個reads很少覆蓋完整的轉錄本，平均而言，細菌大約有1000個核苷酸，并且在真核生物中更長。這種短序列的準確比對和組裝取決于參考基因組的可用性。轉錄本的剪接、mRNA的編輯或基因融合轉錄本的鑒定仍然是一個挑戰。與二代測序相比，納米孔(nanopore)全長轉錄組測序具有沒有讀長上限的限制，不需要進行長度選擇，整個轉錄本可以進行單讀長的端到端測序等優勢，實現了簡單、準確的組裝，并能夠區分高度相似的異構體、識別新轉錄本以及檢測融合。

發明內容

本發明的目的是提供一種納米孔全長轉錄組文庫構建方法。

為實現上述目的，本發明將SMART技術和ONT納米孔測序技術相結合，開發基于SMART和ONT測序技術的覆蓋全長轉錄組的文庫構建方法，該方法利用SMART技術獲得全長轉錄組，再連接納米孔測序接頭得到待測序的文庫樣本，該文庫樣本可用于納米孔三代測序。

具體地，本發明提供以下技術方案：

本發明提供一種納米孔全長轉錄組文庫構建方法，該方法包括：將mRNA富集后，采用SMART技術將mRNA反轉錄制備cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增，將PCR擴增產物進行FFPE和末端修復，再連接納米孔測序接頭。

具體地，mRNA富集為利用mRNA的3’端存在PolyA尾進行mRNA的調取。優選采用偶聯Oligo dT的磁性微球，特異地靶向捕獲初始樣品中的polyA RNA，實現從總RNA中富集得到mRNA。