[發明專利]一種納米孔全長轉錄組文庫構建方法

在審

• 申請號: 202110313236.0
• 申請日: 2021-03-24
• 公開（公告）號: CN113046416A
• 公開（公告）日: 2021-06-29
• 發明（設計）人: 鄭洪坤;劉敏;張夢龍;陳鈺萌;駱晨;趙國瑞
• 申請（專利權）人: 北京百邁客生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12N15/10;C40B50/06;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 商秀玲

1.一種納米孔全長轉錄組文庫構建方法，其特征在于，包括：將mRNA富集后，采用SMART技術將mRNA反轉錄制備cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增，將PCR擴增產物進行FFPE和末端修復，再連接納米孔測序接頭。

2.根據權利要求1所述的納米孔全長轉錄組文庫構建方法，其特征在于，所述反轉錄的引物包括VNP引物和SSP引物，所述VNP引物具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述SSP引物具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

3.根據權利要求2所述的納米孔全長轉錄組文庫構建方法，其特征在于，所述反轉錄的反應體系中，所述VNP引物與所述SSP引物的終濃度之比為1:(5-10)；

優選地，所述反轉錄的反應體系中，所述VNP引物的終濃度為0.06-0.15μM，所述SSP引物的終濃度為0.6-0.7μM。

4.根據權利要求2～3任一項所述的納米孔全長轉錄組文庫構建方法，其特征在于，所述反轉錄的反應條件為：50℃，10min；42℃，10-15min；80℃，10min。

5.根據權利要求1～4任一項所述的納米孔全長轉錄組文庫構建方法，其特征在于，所述PCR擴增使用的引物的序列如SEQ ID NO.3-4所示；

優選地，所述PCR擴增的反應條件為：95℃，30sec；95℃，15sec，62℃，15sec，65℃，6-9min，15-20個循環；65℃，5-10min。

6.根據權利要求1～5任一項所述的納米孔全長轉錄組文庫構建方法，其特征在于，所述FFPE和末端修復的反應條件為：20℃，14-16min；65℃，4-6min。

7.根據權利要求1～6任一項所述的納米孔全長轉錄組文庫構建方法，其特征在于，所述納米孔測序接頭為ONT Adapter Mix；

優選地，所述連接納米孔測序接頭的60μL反應體系包括如下組分：FFPE和末端修復純化產物300-500ng，ONT LBN連接buffer25μL，ONT Adapter Mix測序接頭5μL，T4 DNA連接酶10μL，水補足至總體積；

更優選地，所述連接納米孔測序接頭的反應條件為：22-25℃反應30-45min。

8.用于SMART技術反轉錄的引物，其特征在于，其具有如SEQ ID NO.1-2所示的核苷酸序列。

9.一種納米孔全長轉錄組測序方法，其特征在于，其包括：采用權利要求1～7任一項所述的納米孔全長轉錄組文庫構建方法構建全長轉錄組文庫，以及，以所述全長轉錄組文庫為對象進行測序。

10.根據權利要求9所述的納米孔全長轉錄組測序方法，其特征在于，所述測序利用納米孔測序平臺進行。