[發明專利]基于T7RNA聚合酶的正鏈RNA病毒快速拯救系統及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 202110311686.6
• 申請日: 2021-03-24
• 公開（公告）號: CN112899310B
• 公開（公告）日: 2023-01-24
• 發明（設計）人: 龍健兒;傅美賢
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/65;C12N7/02
• 代理公司: 上海滬慧律師事務所 31311
• 代理人: 嚴忠澤

本發明提供了一種基于T7RNA聚合酶的正鏈RNA病毒快速拯救系統及其構建方法和應用，主要涉及基因工程技術領域。所述系統包括：能夠高效表達T7RNA聚合酶的哺乳動物細胞系、包含T7啟動子及以EV71為例的RNA病毒全基因組cDNA感染性克隆，所用載體與表達T7RNA聚合酶的細胞高效匹配。相較于基于體外轉錄的RNA病毒拯救系統，本發明能夠簡單、高效地拯救出感染性正鏈RNA病毒，以EV71為例，所產生病毒能夠連續傳代，與親本病毒具有一致的生物學特性。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別是涉及一種基于T7RNA聚合酶的正鏈RNA病毒快速拯救系統及其構建方法和應用。

背景技術

T7 RNA聚合酶(T7pol)，是一種高度特異性識別T7啟動子序列的DNA依賴的5′→3′RNA聚合酶。由于T7pol啟動轉錄效率較強且具有嚴格的啟動子識別特異性，所以基于T7pol的病毒拯救系統應用非常廣泛。

腸道病毒EV71(Enterovirus 71，EV71)為非包膜的正鏈RNA病毒，是小RNA病毒(Picornaviridae)家族中腸病毒屬成員。該病毒感染主要引起嬰幼兒手足口病(hand-foot-and-mouth disease，HFMD)，還可能導致神經系統并發癥，甚至死亡。EV71病毒基因組全長約為7.4kb，可作為mRNA編碼一個小的上游蛋白和一個大的多聚蛋白。而多聚蛋白最終會被加工形成四個結構蛋白(VP1-VP4)和七個非結構病毒蛋白(2A，2B，2C，3A，3B，3C和3D)。盡管2015年EV71滅活病毒疫苗已獲得中國許可。但截至目前，針對EV71病毒的特效藥物仍未被發現，關于EV71病毒的致病機制仍需科研人員進行更深入的研究。

病毒基因組的遺傳操作和感染性病毒的拯救能夠給研究者帶來諸多便利。因此近十年來，國內外有多個實驗室曾對EV71 cDNA感染性克隆進行構建。但通常在完成病毒cDNA克隆的構建后，病毒的拯救還需要對cDNA進行線性化，并進一步在體外用RNA聚合酶轉錄，然后將純化的高質量RNA轉染到細胞中，才可能獲得具有感染性的病毒。這些步驟不僅較為繁瑣，還存在多種限制因素，導致病毒拯救不容易成功。如感染性克隆的線性化需要匹配合適的酶切位點，并且通常需要大量的感染性克隆質粒，而長鏈基因組感染性克隆的構建常常會使得質粒的拷貝數降低，從而影響高濃度的感染性克隆質粒的獲取。除此之外，線性化后的cDNA進行體外轉錄所獲得的RNA完整性也是影響拯救病毒實驗成功的關鍵因素。

發明內容

針對目前的正鏈RNA病毒拯救系統在構建及病毒拯救的過程中存在的缺陷和問題，本發明的目的在于提供了一種以EV71腸道病毒作為模型，基于T7RNA聚合酶的正鏈RNA病毒快速拯救系統及其構建方法和應用。

為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：

本發明提供了一種基于T7 RNA聚合酶的正鏈RNA病毒快速拯救系統，包括：能夠表達T7 RNA聚合酶(T7pol)的哺乳動物細胞系、包含T7啟動子及有正鏈RNA病毒核酸序列的感染性克隆；

所述感染性克隆在病毒核酸序列的5'端上游含T7啟動子；

所述正鏈RNA病毒包括但不限于EV71腸道病毒。

優選的，其中所述哺乳動物細胞系為慢病毒整合介導表達T7pol的HEK293FT/T7pol細胞系，或通過轉染含T7pol基因表達質粒的HEK293FT細胞。

優選的，其中所述感染性克隆的質粒骨架為pcDNA3.1+，且所述pcDNA3.1+的結構中不含有CMV啟動子。

優選的，其中所述哺乳動物細胞系為整合慢病毒載體并介導T7 RNA聚合酶T7pol表達的細胞系、或瞬時轉染含T7 RNA聚合酶T7pol基因質粒后表達T7 RNA聚合酶T7pol的細胞系。