[發(fā)明專利]基于T7RNA聚合酶的正鏈RNA病毒快速拯救系統(tǒng)及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110311686.6
• 申請(qǐng)日: 2021-03-24
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112899310B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-01-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 龍健兒;傅美賢
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/867
• 分類號(hào): C12N15/867;C12N15/65;C12N7/02
• 代理公司: 上海滬慧律師事務(wù)所 31311
• 代理人: 嚴(yán)忠澤

1.一種基于T7 RNA聚合酶的正鏈RNA病毒快速拯救系統(tǒng)，其特征在于，它包括：能夠表達(dá)T7pol的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系、包含T7啟動(dòng)子及正鏈RNA病毒核酸序列的感染性克隆；

所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞系為整合慢病毒載體并介導(dǎo)T7pol表達(dá)的細(xì)胞系，該細(xì)胞系整合有SV40的T抗原，該細(xì)胞系包括HEK293FT或COS7細(xì)胞；所述慢病毒載體的質(zhì)粒骨架為真核表達(dá)載體pCDH-CMV-EF1-puro，所述真核表達(dá)載體pCDH-CMV-EF1-puro的結(jié)構(gòu)中含有SV40ori復(fù)制起始元件，并且T7pol的5’-端融合3個(gè)Flag表達(dá)標(biāo)簽；

所述感染性克隆在病毒核酸序列的5 '端上游含T7啟動(dòng)子；所述正鏈RNA病毒包括EV71腸道病毒。

2.如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述感染性克隆的質(zhì)粒骨架為pcDNA3.1+，且所述pcDNA3.1+質(zhì)粒結(jié)構(gòu)中不含有CMV啟動(dòng)子。

3.一種權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述的基于T7 RNA聚合酶的正鏈RNA病毒快速拯救系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：

能夠表達(dá)T7pol的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的構(gòu)建；

包含T7啟動(dòng)子及正鏈RNA病毒核酸序列的感染性克隆的構(gòu)建。

4.如權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述能夠表達(dá)T7 RNA聚合酶的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的構(gòu)建包括以下步驟：

a將T7pol基因與易于檢測(cè)表達(dá)的5’端融合蛋白標(biāo)簽3Flags定向插入到真核表達(dá)載體pCDH-CMV-EF1-puro的CMV啟動(dòng)子下游，從而得到含有T7pol、融合蛋白標(biāo)簽3Flags、嘌呤霉素抗性基因的雙順?lè)醋勇《据d體pCDH-CMV-3Flags-T7pol-EF1-puro；

b將雙順?lè)醋勇《据d體pCDH-CMV-3Flags-T7pol-EF1-puro、慢病毒包裝質(zhì)粒psPAX2和慢病毒包膜質(zhì)粒pMD2.G按4:3:1的質(zhì)量比例混合后，轉(zhuǎn)染到HEK293FT中，得到整合有pCDH-CMV-3Flags-T7pol-EF1-puro基因的慢病毒；

c將整合有pCDH-CMV-3Flags-T7pol-EF1-puro基因的慢病毒感染HEK293FT細(xì)胞，再通過(guò)含嘌呤霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，得到整合有T7pol基因的穩(wěn)定細(xì)胞HEK293FT/T7pol。

5.一種利用權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述的基于T7 RNA聚合酶的正鏈RNA病毒快速拯救系統(tǒng)拯救腸道病毒 EV71的方法，其特征在于，包括以下步驟：將含有腸道病毒 EV71全長(zhǎng)基因組的感染性克隆pcDNA3.1-?CMV-T7-EV71-poly(dT)30，以及與作為轉(zhuǎn)染效率指示劑的綠色熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒pCDH-CMV-EF1-GFP混合后，轉(zhuǎn)染至HEK293FT/T7pol細(xì)胞中，在含5％（v/v）CO₂的37℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，當(dāng)90％的細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變后收集病毒。