[發(fā)明專利]一種基于CRISPR-Cas13a蛋白快速檢測非洲豬瘟病毒的方法

在審

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• 申請日: 2021-03-23
• 公開（公告）號: CN113046480A
• 公開（公告）日: 2021-06-29
• 發(fā)明（設計）人: 曾建紅;張小蘭
• 申請（專利權）人: 樂尚生物科技（無錫）有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 無錫經(jīng)誠知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 32504
• 代理人: 吳仁芬

本發(fā)明涉及分子生物學技術領域，具體是一種基于CRISPR?Cas13a蛋白快速檢測非洲豬瘟病毒的方法，包括制備Cas13a蛋白，設計并合成適合RPA擴增的引物，設計并合成適合Cas13a蛋白的crRNA，設計并合成RNA報告分子，設計并合成陽性質粒，制備陽性質粒，配制擴增檢測體系和檢測。本方法可以快速準確地鑒定非洲豬瘟病毒DNA，操作簡便，無需像PCR一樣通過變溫儀器來實現(xiàn)擴增檢測，只需在37℃下進行等溫擴增即可完成檢測。

技術領域

本發(fā)明涉及分子生物學技術領域，尤其涉及一種基于CRISPR-Cas13a蛋白快速檢測非洲豬瘟病毒的方法。

背景技術

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)引起的豬的一種傳染性疾病。非洲豬瘟傳播快，致死率高，對養(yǎng)豬業(yè)危害巨大，被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為需要報告的動物疫病，被我國列為一類動物疾病。迄今為止，非洲豬瘟已在非洲、歐洲和美洲等幾十個國家暴發(fā)。非洲豬瘟在中國疫情的發(fā)現(xiàn)形勢業(yè)非常嚴峻，對我國的養(yǎng)殖業(yè)造成很大的風險。目前為止，非洲豬瘟病毒還沒有效的疫苗及藥物，防治難度大，唯一有效措施就是進行撲殺。此外，非洲豬瘟病毒生存力極強，傳播途徑也多種多樣，極易造成疫情的散播與擴大。因此建立簡便、快速、準確的非洲豬瘟病毒檢測方法顯得十分必要。

目前非洲豬瘟病毒的檢測方法主要有免疫檢測和分子檢測。免疫檢測，即抗體和抗原酶聯(lián)免疫吸附檢測，簡稱ELISA檢測，應用于血清抗體的檢測，具有操作方便、特異性較好、靈敏度高的特點，適用于大批量樣品的檢測，世界動物衛(wèi)生組織將ELISA作為診斷ASF的首選血清學方法。分子檢測，主要是PCR方法，是目前非洲豬瘟病毒最常用的實驗室檢測方法。

用血清學方法檢測抗體可以了解病毒感染以及疾病發(fā)生、發(fā)展的進程，然而，由于抗體只有在病毒感染至一定時期后才會出現(xiàn)，甚至一些病豬由于病程發(fā)展迅速，在發(fā)病死亡后仍然沒有出現(xiàn)抗體。因此，抗體檢測在作為快速控制ASFV暴發(fā)的方法時存在局限性。PCR檢測具有通量高、結果直觀、敏感性高、特異性強、重復性好等優(yōu)點，已成為非洲豬瘟病原體檢測的重要方法。但PCR法需要昂貴的儀器，對實驗場地和人員要求比較高，難以適用于現(xiàn)場大規(guī)模篩查。

因此，急需一種新的技術方案來解決上述問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術的問題，提供了一種基于CRISPR-Cas13a蛋白快速檢測非洲豬瘟病毒的方法，可方便快速準確地鑒定非洲豬瘟病毒DNA，操作簡便，無需像PCR一樣通過變溫儀器來實現(xiàn)擴增檢測，只需在37℃下進行等溫擴增即可完成檢測。

上述目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)：

一種基于CRISPR-Cas13a蛋白快速檢測非洲豬瘟病毒的方法，包括如下步驟：

步驟(1)制備Cas13a蛋白；

步驟(2)設計并合成適合RPA擴增的引物；

步驟(3)設計并合成適合Casl3a蛋白的crRNA；

步驟(4)設計并合成RNA報告分子；

步驟(5)設計并合成陽性質粒；

步驟(6)制備陽性質粒；

步驟(7)配制擴增檢測體系；

步驟(8)檢測。

進一步地，所述步驟(1)具體包括如下步驟：