[發明專利]一種基于CRISPR-Cas13a蛋白快速檢測非洲豬瘟病毒的方法

在審

• 申請號: 202110311002.2
• 申請日: 2021-03-23
• 公開（公告）號: CN113046480A
• 公開（公告）日: 2021-06-29
• 發明（設計）人: 曾建紅;張小蘭
• 申請（專利權）人: 樂尚生物科技（無錫）有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 無錫經誠知識產權代理事務所(普通合伙) 32504
• 代理人: 吳仁芬

1.一種基于CRISPR-Cas13a蛋白快速檢測非洲豬瘟病毒的方法，其特征在于：包括如下步驟：

步驟(1)制備Cas13a蛋白；

步驟(2)設計并合成適合RPA擴增的引物；

步驟(3)設計并合成適合Cas13a蛋白的crRNA；

步驟(4)設計并合成RNA報告分子；

步驟(5)設計并合成陽性質粒；

步驟(6)制備陽性質粒；

步驟(7)配制擴增檢測體系；

步驟(8)檢測。

2.根據權利要求1所述的一種基于CRISPR-Cas13a蛋白快速檢測非洲豬瘟病毒的方法，其特征在于：所述步驟(1)具體包括如下步驟：

步驟(a)在NCBI上查找Leptotrichia wadei編碼Cas13a基因序列，所述Cas13a基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示、氨基酸序列如SEQ ID No.6所示，人工合成得到Cas13a基因全長片段，并克隆到T載體上，然后用NdeI和SacI雙酶切，并將此片段克隆至pET-28a表達載體的NdeI和SacI酶切位點之間，構建表達載體pET-28a-Cas13a；

步驟(b)將步驟(a)中所述構建表達載體pET-28a-Cas13a轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中，并涂于含30μg/ml Kan平板上，37℃培養12h-16h，挑取單克隆菌株，加入1L終濃度為30μg/ml的Kan的LB液體培養基中培養4h，再加入終濃度為0.7mM的IPTG誘導，30℃過夜培養，收取菌液，5000rpm離心30min，得菌體；

步驟(c)用緩沖液對步驟(b)中得到的所述菌體進行超聲破碎，取上清，10000rpm離心30min，純化后用緩沖液沖洗至基線水平，然后用含咪唑濃度為250mM的緩沖液洗脫蛋白，洗脫后的蛋白經過sephadex G25色譜柱脫鹽得到蛋白，-70℃保存，得到純化后的Cas13a蛋白。

3.根據權利要求1所述的一種基于CRISPR-Cas13a蛋白快速檢測非洲豬瘟病毒的方法，其特征在于：所述步驟(2)具體為：根據保守的非洲豬瘟病毒VP72基因，設計特異檢測非洲豬瘟病毒的上游引物和下游引物，將設計好的所述上游引物和所述下游引物在NCBI中進行blast，顯示是特異的非洲豬瘟病毒序列；

所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述非洲豬瘟病毒VP72基因的序列如SEQ ID NO.4所示。

4.根據權利要求1所述的一種基于CRISPR-Cas13a蛋白快速檢測非洲豬瘟病毒的方法，其特征在于：所述步驟(3)具體為：根據Cas13a蛋白的特點，在擴增的基因片段序列直接設計特異識別非洲豬瘟病毒的crRNA，在NCBI中進行blast，顯示是特異的非洲豬瘟病毒序列；所述crRNA的核酸序列如SEQ ID NO.3所示。

5.根據權利要求4所述的一種基于CRISPR-Cas13a蛋白快速檢測非洲豬瘟病毒的方法，其特征在于：所述步驟(4)具體為：根據Cas13a蛋白的特點，設計的RNA報告分子，所述RNA報告分子的序列為熒光報告基團-TUUUUUC-熒光淬滅基團，所述熒光報告基團為FAM、HEX、TET、JOE或VIC；所述熒光淬滅基團為BHQ1、BHQ2或BHQ3。

6.根據權利要求5所述的一種基于CRISPR-Cas13a蛋白快速檢測非洲豬瘟病毒的方法，其特征在于：所述RNA報告分子的序列為FAM-TUUUUUC-BHQ1，5′端修飾FMA熒光基團，3′端修飾BHQ1淬滅基團。

7.根據權利要求1所述的一種基于CRISPR-Cas13a蛋白快速檢測非洲豬瘟病毒的方法，其特征在于：所述步驟(5)具體為：將非洲豬瘟病毒VP72基因的核酸序列克隆到pUc57質粒中，克隆位點為SamI，抗性為氨芐抗性，克隆菌株為DH5α。