[發明專利]一種用于抗CTLA-4單克隆抗體生物學活性檢測的RGA方法及其應用

有效

• 申請號: 202110308027.7
• 申請日: 2021-03-23
• 公開（公告）號: CN113009157B
• 公開（公告）日: 2022-03-08
• 發明（設計）人: 王蘭;劉春雨;于傳飛;楊雅嵐;崔永霏;段茂芹;俞小娟;徐苗;王軍志
• 申請（專利權）人: 中國食品藥品檢定研究院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/577;C12Q1/66;C12N5/10;C12N15/13;C12N15/12;C12N15/65
• 代理公司: 北京預立生科知識產權代理有限公司 11736
• 代理人: 李紅偉;孟祥斌

本發明公開了一種用于抗CTLA?4單克隆抗體生物學活性檢測的RGA方法及其應用。所述方法包括構建得到穩定表達CD3scFv的靶細胞，以及穩定表達CTLA?4基因和報告基因的效應細胞，將靶細胞和效應細胞按照一定的比例進行混合后，加入抗CTLA?4單克隆抗體藥物樣品及參比品激活信號通路，根據測定的報告基因信號值擬合四參數曲線確定抗體的生物學活性。本發明針對抗CTLA?4單克隆抗體生物學活性檢測建立了準確、靈敏、快速、專屬性強、耐用性高的定量檢測方法，對抗CTLA?4單克隆抗體的質量控制和臨床應用具有重要的意義。

技術領域

本發明屬于生物醫藥技術領域，涉及一種生物活性的檢測方法，具體而言，涉及一種用于抗CTLA-4單克隆抗體生物學活性檢測的RGA方法及其應用。

背景技術

細胞毒性T淋巴細胞相關抗原-4(cytotoxic T-Lymphocyte-associatedantigen-4,CTLA-4)，又名CD152，基因位于2號染色體長臂3區3帶(2q33)，編碼233個氨基酸，是免疫球蛋白相關受體家族成員之一。CTLA-4表達于活化的T細胞的表面，其在T細胞中高表達能顯著抑制T細胞活性，進而削弱T細胞殺傷癌細胞的能力，是T細胞免疫應答的重要負調節因子，同時，CTLA-4也是第一個發現的作為腫瘤免疫療法中具有治療潛力的免疫檢查點。T細胞的活化同時依賴于兩種信號：一種為抗原信號，另一種為共刺激信號。抗原信號主要由T細胞表面的T細胞受體(TCR)識別并結合抗原呈遞細胞(APC)表面的的主要組織相容性復合物(MHC)分子而產生，共刺激信號主要由T細胞表面的協同刺激分子CD28與抗原呈遞細胞表面的的B7分子結合而產生。

以往針對腫瘤的免疫治療，主要包括開發小分子靶點藥物、抗腫瘤疫苗和過繼性細胞免疫治療等手段，近年來，開發靶向腫瘤免疫檢查點的抑制劑，成為一種新型的免疫療法。例如，通過設計靶向CTLA-4的阻斷劑，降低其對T細胞活化的抑制作用，從而達到抗腫瘤的目的。開發靶向CTLA-4的抗體藥物用于腫瘤的免疫治療是目前的研究熱點之一。當前市場上具有代表性的CTLA-4單抗藥物主要有Ipilimumab(伊匹木單抗)和Tremelimumab，臨床上主要用于黑色素瘤等實體瘤的治療，相對于傳統的化療取得了更好的療效。

目前，仍然缺乏基于細胞的生物學活性測定方法來檢測抗CTLA-4單克隆抗體的生物學活性，本發明開發并驗證了一種報告基因測定方法(RGA)，通過構建兩種細胞株以測定CTLA-4單克隆抗體的生物學活性，分別是穩定表達抗CD3單鏈抗體片段(scFv)的靶細胞，稱為Raji-CD3scFv細胞株，以及穩定表達CTLA-4基因和由NFAT應答元件驅動表達的熒光素酶報告基因的效應細胞，稱為Jurkat-CTLA-4-NFAT-luc細胞株，該方法顯示出良好的專屬性、準確性、精密度和耐用性，同時，該方法對抗CTLA-4單克隆抗體藥物的結構變化敏感，不僅能用于批次質量放行和穩定性的檢測，還可以用于新的抗CTLA-4單克隆抗體的開發和表征中。

發明內容

針對現有的抗CTLA-4單克隆抗體的生物學活性檢測方法的不足，本發明的目的在于提供用于抗CTLA-4單克隆抗體生物學活性檢測的RGA方法，所述方法包括構建得到穩定表達CD3 scFv的Raji靶細胞，以及穩定表達CTLA-4基因和熒光素酶報告基因的Jurkat效應細胞，將靶細胞和效應細胞按照一定比例混合后，加入抗CTLA-4單克隆抗體藥物樣品進行檢測。通過對所述方法的優化、驗證和實際應用，證明了該方法能夠用于抗CTLA-4單克隆抗體的穩定性測試，以及抗CTLA-4單克隆抗體藥物的活性評價和批次質量放行。

本發明的上述目的通過以下技術方案得以實現：

本發明的第一方面提供了一種用于抗CTLA-4單克隆抗體生物學活性檢測的RGA方法。