[發明專利]一種PHA合酶N端缺失突變體構建方法及應用

在審

• 申請號: 202110307034.5
• 申請日: 2021-03-23
• 公開（公告）號: CN113046287A
• 公開（公告）日: 2021-06-29
• 發明（設計）人: 胡風慶;李巍巍;寧崇
• 申請（專利權）人: 遼寧大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P7/62;C12R1/19
• 代理公司: 沈陽杰克知識產權代理有限公司 21207
• 代理人: 金春華

本發明涉及分子生物學領域，具體涉及一種PHA合酶N端缺失突變體構建的方法。通過設計引物對嗜水氣單胞菌PHA合酶進行克隆，然后構建N端第2到28位氨基酸的缺失突變的重組質粒的方法。經酶切測序確認表達載體構建成功后轉化到富養產堿菌(Ralstonia eutropha)突變株PHB^?4中選擇不同碳源搖瓶發酵驗證PHA合酶功能活性，然后與野生型嗜水氣單胞菌比較。通過本發明的方法，發現了N端突變的合酶基因具有產生PHA的功能，且PHA產量要高于野生菌，提高了PHA產量。這對今后利用基因工程技術構建產新型PHA的嵌合酶提供了理論基礎在促進PHA更廣泛的應用方面有一定價值。

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，具體涉及一種PHA合酶N端缺失突變體構建的方法。

技術背景

聚羥基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanonate)是一種由許多細菌在營養不平衡條件下合成的胞內能量和碳源貯藏性的物質。PHA有著良好的生物相容性、生物可降解性、憎水性以及由不同官能團帶來的獨特性質，被用作組織工程材料藥物緩釋材料，是一種有很好發展潛力的生物材料。不溶于水的高分子量PHAs表現出了熱塑性塑料和或彈性功能，以及其他的物理和材料學功能，包括生物降解，生物相容性，壓電性等，吸引了越來越多工業界的注意。PHA有許多潛在的用途，如作為大宗商品塑料，漁線，梭織材料，和潛在的生物醫學應用。

目前PHA生產存在著生產成本高、產量低、成分單一的問題。PHA合酶是PHA合成過程中的關鍵酶，它的活性和底物特異性決定著PHA的含量和組成。在對PHA合酶進行缺失突變研究時發現，PHA合酶的N端與酶的性質，例如底物特異性、酶活性、耐熱性相關，對于聚合反應，最終聚合物的組分起著重要作用。本研究旨在通過對N端的改造來改變PHA合酶的底物特異性，提高PHA合酶的催化活性，提高PHA產量。

富氧產堿菌(R.eutropha)PHA合酶具有很高的酶活性但是只產生PHB。而嗜水氣單胞菌WQ(A.hydrophila WQ)PHA合酶有廣泛的底物范圍、產生P(3HB-co-3HHx)，但是其生產PHA能力低。基于這兩個親本，對PHA合酶的N端進行改造以產生新型PHA具有重大理論和實踐意義。

發明內容

本發明的目的在于對合酶基因N端進行缺失突變研究，研究N端對于合酶性質的影響，改變PHA合酶的底物特異性，提高PHA合酶的催化活性，提高PHA產量以及便于將來構建PHA嵌合酶。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案是：一種通過克隆設計引物構建PHA合酶N端缺失突變的方法，包括如下步驟：一種PHA合酶N端缺失突變體構建的方法，包括如下步驟：

1)從NCBI中獲得嗜水氣單胞菌WQ(A.hydrophila WQ)的序列，并以此序列設計引物P1、P2；

P1-5’-TTAAAGCTTCTAATGGAGCGCACCGCCCAG-3’P2-5’-TTTGAATTCTCATGCGGCGTCCTCCTCT-3’

2)以pUC19-phaPCJ_WQ為模板，以P1、P2為引物，PCR擴增獲得phaPCJ_WQ；

3)將步驟2)得到的phaPCJ_WQ采用切膠回收后經HindIII和EcoRI雙酶切后插入經過酶切的表達載體pBBR1MCS2中，經T4連接酶連接，得重組質粒pBBR1MCS2-phaC′J_WQ；