[發明專利]一種PHA合酶N端缺失突變體構建方法及應用

在審

• 申請號: 202110307034.5
• 申請日: 2021-03-23
• 公開（公告）號: CN113046287A
• 公開（公告）日: 2021-06-29
• 發明（設計）人: 胡風慶;李巍巍;寧崇
• 申請（專利權）人: 遼寧大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P7/62;C12R1/19
• 代理公司: 沈陽杰克知識產權代理有限公司 21207
• 代理人: 金春華

1.一種PHA合酶N端缺失突變體構建的方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)從NCBI中獲得嗜水氣單胞菌WQ(A.hydrophila WQ)的序列，并以此序列設計引物P1、P2；

P1-5’-TTAAAGCTTCTAATGGAGCGCACCGCCCAG-3’P2-5’-TTTGAATTCTCATGCGGCGTCCTCCTCT-3’

2)以pUC19-phaPCJ_WQ為模板，以P1、P2為引物，PCR擴增獲得phaPCJ_WQ；

3)將步驟2)得到的phaPCJ_WQ采用切膠回收后經HindIII和EcoRI雙酶切后插入經過酶切的表達載體pBBR1MCS2中，經T4連接酶連接，得重組質粒pBBR1MCS2-phaC′J_WQ；

4)將重組質粒pBBR1MCS2-phaC′J_WQ轉化大腸桿菌S17-1感受態細胞，所得菌液涂布于含有Kan抗性的LB平板上，培養后挑取陽性克隆，培養后提取重組質粒pBBR1MCS2-phaC′J_WQ經HindIII和EcoRI雙酶切，篩選陽性轉化子，再將得到的陽性轉化子與PHA合酶缺失突變株PHB^-4共培養，將重組質粒pBBR1MCS2-phaC′J_WQ轉化到PHB^-4中得到重組菌。

2.根據權利要求1所述的一種PHA合酶N端缺失突變體構建的方法，其特征在于，步驟2)中反應體系為50μl：ddH₂O32.5μl；10×Pfu Buffer5μl；2.5mM dNTP5μl；Mg²⁺4μl；模板DNA1μl；25μM引物11μl；25μM引物21μl；5U/μl Pfu酶0.5μl；

3.根據權利要求1所述的一種PHA合酶N端缺失突變體構建的方法，其特征在于，步驟2)中擴增條件為：95℃預變性5min；94℃變性30sec；62℃退火30sec；72℃延伸2.5min，25個循環；72℃延伸10min。

4.根據權利要求1所述的一種PHA合酶N端缺失突變體構建的方法，其特征在于，步驟4)中，所述的培養是37℃培養過夜。

5.按照權利要求1所述的一種PHA合酶N端缺失突變體構建的方法生產的重組菌在生產PHA中的應用。