[發明專利]用于現場檢測布魯氏桿菌的通用型引物組、試劑盒及方法

在審

• 申請號: 202110306954.5
• 申請日: 2021-03-23
• 公開（公告）號: CN112941212A
• 公開（公告）日: 2021-06-11
• 發明（設計）人: 張雪;白璐;尹新穎;樸永哲;劉冉
• 申請（專利權）人: 大連海關技術中心
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 大連瑞博晟知識產權代理有限公司 21259
• 代理人: 楊迪

1.用于現場檢測布魯氏桿菌的通用型引物組，其特征在于，所述引物組由下述引物組成：

Bru-OF CCCGACTTGATCGCATTGA SEQ ID No.1；

Bru-OB CGTTGGGAGCGAGCTTTG SEQ ID No.2；

Bru-IF ATTTCCGGCGCAGGCGAAAATATTGGCAACCGAGCCATTC SEQ ID No.3；

Bru-IB TTCGCGATCAGACCACCAATCGTTTTTCCGTATCGGCACTGG SEQ ID No.4；

Bru-LB GATAATAGGTTCCGGCTGTGC SEQ ID No.5。

2.一種用于現場檢測布魯氏桿菌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括以下組成物：

(1)用于現場檢測布魯氏桿菌的通用型引物組：

Bru-OF CCCGACTTGATCGCATTGA SEQ ID No.1；

Bru-OB CGTTGGGAGCGAGCTTTG SEQ ID No.2；

Bru-IF ATTTCCGGCGCAGGCGAAAATATTGGCAACCGAGCCATTC SEQ ID No.3；

Bru-IB TTCGCGATCAGACCACCAATCGTTTTTCCGTATCGGCACTGG SEQ ID No.4；

Bru-LB GATAATAGGTTCCGGCTGTGC SEQ ID No.5；

(2)恒溫擴增的反應體系20～50μL：2.6～3.0mmol/L dNTP Mixture、30～50mmol/LTris-HCl、10～30mmol/L KCL、12～20mmol/L MgSO4、10～30mmol/L(NH4)2SO4、1.2～2.0mol/L甜菜堿、6～10U/μL Bst DNA聚合酶、1.4～1.8μmol/L Bru-IF、1.4～1.8μmol/LBru-IB、0.1～0.3μmol/L Bru-OF、0.1～0.3μmol/L Bru-OB、0.6～1.0μmol/L Bru-LB、DEPC水；

(3)陽性對照和空白對照，所述陽性對照為含如SEQ ID NO.6所示序列的陽性質粒，所述空白對照為去核酸的超純水。

3.根據權利要求2所述的一種用于現場檢測布魯氏桿菌的試劑盒，其特征在于，所述恒溫擴增的反應體系總體積為25μL，其中，所述反應體系中包括2.8mmol/L dNTP Mixture、40mmol/L Tris-HCl、20mmol/L KCL、16mmol/L MgSO4、20mmol/L(NH4)2SO4、1.6mol/L甜菜堿、8U/μL Bst DNA聚合酶、2×SYBR Green I、1.6μmol/L Bru-IF、1.6μmol/L Bru-IB、0.2μmol/L Bru-OF、0.2μmol/L Bru-OB、0.8μmol/L Bru-LB、樣品DNA模板1～100ng，DEPC水。

4.一種采用權利要求2所述試劑盒現場檢測布魯氏桿菌的檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟S1、從樣品中提取DNA；

步驟S2、對所述DNA進行恒溫擴增；

步驟S3、結果判定：

若有“S”型熒光信號擴增曲線，Ct值35，則判斷為陽性；

若無“S”型熒光信號擴增曲線，無Ct值或Ct值45則判斷為陰性；

若Ct值在35-45之間，重復實驗，若Ct值45，熒光信號擴增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽性，否則為陰性。