[發明專利]一種用于檢測β-乳球蛋白的膠體金免疫層析試紙及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 202110306432.5
• 申請日: 2021-03-23
• 公開（公告）號: CN113030486A
• 公開（公告）日: 2021-06-25
• 發明（設計）人: 薛海燕;宋宏新;賀寶元;韓晶晶;張思冉;伊美霞
• 申請（專利權）人: 陜西科技大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/58;G01N33/577;G01N33/558;G01N33/531;G01N33/532;C07K16/18
• 代理公司: 西安合創非凡知識產權代理事務所(普通合伙) 61248
• 代理人: 于波

1.一種用于檢測β-乳球蛋白的膠體金免疫層析試紙，其特征在于，所述試紙包括金標墊、樣品墊、吸水墊和NC膜，所述金標墊中含有膠體金標記的鼠抗牛β-乳球蛋白單克隆抗體，所述金標記的鼠抗牛β-乳球蛋白單克隆抗體以鼠抗牛β-乳球蛋白單克隆抗體量記為0.25μg/cm²，所述NC膜上設置有T檢測線，所述T檢測線上鼠抗牛β-乳球蛋白單克隆抗體以牛β-乳球蛋白單克隆抗體量計為0.00625μg/cm²。

2.一種用于檢測β-乳球蛋白的膠體金免疫層析試紙，其特征在于，所述NC膜上還設置有C質控線，所述C質控線上含有羊抗鼠IgG的抗體，所述C質控線上羊抗鼠IgG的抗體以羊抗鼠IgG抗體量計為0.00625μg/cm²。

3.一種權利要求1或2所述的膠體金免疫層析試紙的制備方法，其特征在于，包括：

S1：將膠體金標記的鼠抗牛β-乳球蛋白單克隆抗體溶液噴涂至金標墊上；

S2：將鼠抗牛β-乳球蛋白單克隆抗體溶液噴涂至NC膜的T檢測線上；

S3：將羊抗鼠IgG抗體溶液噴涂至NC膜的C質控線上；

S4：將金標墊、樣品墊、吸水墊、NC膜組裝成試紙；

所述金標墊上膠體金標記的鼠抗牛β-乳球蛋白單克隆抗體以鼠抗牛β-乳球蛋白單克隆抗體量記為0.25μg/cm²；

所述T檢測線上鼠抗牛β-乳球蛋白單克隆抗體以牛β-乳球蛋白單克隆抗體量計為0.00625μg/cm²；

所述C質控線上羊抗鼠IgG的抗體以羊抗鼠IgG抗體量計為0.00625μg/cm²。

4.根據權利要求3所述的膠體金免疫層析試紙的制備方法，其特征在于，包括：

S5：鼠抗牛β-乳球蛋白單克隆抗體的制備及純化；

S6：膠體金制備，鼠抗牛β-乳球蛋白單克隆抗體膠體金標記及純化；

S7：將膠體金標記的鼠抗牛β-乳球蛋白單克隆抗體溶液噴涂至金標墊上，所述金標墊上膠體金標記的鼠抗牛β-乳球蛋白單克隆抗體以鼠抗牛β-乳球蛋白單克隆抗體量記為0.25μg/cm²；

S8：用PBS緩沖液制備鼠抗牛β-乳球蛋白單克隆抗體溶液，并采用噴金點膜儀噴涂至NC膜的T檢測線上；所述T檢測線上鼠抗牛β-乳球蛋白單克隆抗體以牛β-乳球蛋白單克隆抗體量計為0.00625μg/cm²；

S9：用PBS緩沖液制備羊抗鼠IgG抗體溶液，并采用噴金點膜儀噴涂至NC膜的C質控線上；所述C質控線上羊抗鼠IgG的抗體以羊抗鼠IgG抗體量計為0.00625μg/cm²；

S10：將金標墊、樣品墊、吸水墊和NC膜組裝成試紙。

5.根據權利要求4所述的膠體金免疫層析試紙的制備方法，其特征在于，所述步驟S5中鼠抗牛β-乳球蛋白單克隆抗體的制備及純化過程：

S11：動物免疫：用牛乳β-LG蛋白作為抗原免疫雌性BALB/c小鼠，免疫劑量為30μg/只，第14天，注射等量量福氏不完全佐劑乳化的抗原，第21天，進行常規免疫；30天后，劑量減半，進行加強免疫一次；

S12：細胞融合：將S11中得到的免疫小鼠脾細胞和NS-1骨髓瘤細胞以5:1的比例混合，在50% PEG作用下進行融合，將融合后的細胞懸液于37℃、5%的CO₂內培養；

S13：雜交瘤細胞篩選：融合5天后，加入HAT培養基，10天后交換HT培養基，一段時間后用間接ELISA法進行抗體篩選，篩選出對牛乳β-乳球蛋白特異性強，對羊β-乳球蛋白親和性低的單克隆抗體并進行單克隆抗體細胞株的鑒定；

S14：將陽性的雜交瘤細胞用有限稀釋法進行亞克隆，擴大培養雜交瘤細胞并進行純化，獲得單克隆抗體，所述單克隆抗體的效價＞1:204800，置于-80℃保存。